乙型肝炎病毒表面抗原抑制巨噬细胞TLR4信号传导通路及其机制的初步研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染引起的慢性乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病。全球约有3.5亿慢性乙型肝炎患者,慢性乙型肝炎患者会进一步发展成为肝硬化和肝癌。目前,对于乙型肝炎病毒感染慢性化的机制尚不清楚,一般认为由病毒复制损害免疫系统功能与机体免疫应答不足两个因素复杂作用造成的。天然免疫系统作为抵抗病毒的第一道防线,其功能受损,往往会造成后续适应性免疫应答缺损,造成持续性感染。巨噬细胞是天然免疫中非常重要的组成部分,是专职的抗原递呈细胞,在启动病毒特异性的T细胞免疫应答中扮演了关键的角色。已有文献报道HBV能够抑制巨噬细胞的功能,但是具体机制尚不清楚。乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen,HBsAg）在患者肝脏和血液中大量存在,推测其可能在HBV感染慢性化过程中扮演了重要的角色。本课题前期研究发现,慢性乙肝患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）表达的TLR4水平以及TLR4介导的细胞因子分泌水平低于正常对照,且与血清HBsAg的量直接相关,据此推测HBsAg抑制了TLR4信号转导通路。鉴于TLR4主要在单核巨噬细胞中表达,因此,本课题以PMA分化的THP-1和小鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象,研究HBsAg对巨噬细胞TLR4信号通路的影响,并从HBsAg能否被巨噬细胞吞噬,HBsAg对巨噬细胞表面TLR4表达的影响,TLR4下游信号通路的活化以及细胞因子的产生四个方面深入研究其中的分子机制。首先,用HBsAg处理PMA分化的THP-1细胞,流式细胞术检测发现细胞表面TLR4分子的表达水平下调。为证实HBsAg对TLR4下游信号转导产生的影响,用不同剂量HBsAg处理PMA分化的THP-1细胞并用LPS激活TLR4信号通路。Western Blot检测发现,HBsAg能够以剂量依赖的方式抑制TLR4下游JNK和p38信号通路的磷酸化,但是对ERK信号通路却没有显著影响。进一步研究HBsAg对JNK/p38信号通路磷酸酶MKP-1（负向调控因子）和JNK上游激酶MKK4（正向调控因子）的影响。结果显示,HBsAg并不影响MKP-1的表达水平,但是抑制MKK4的磷酸化。上述结果提示,HBsAg可抑制单核巨噬细胞TLR4分子的表达及TLR4信号通路的活化,其对信号通路作用的关键位点在TLR4信号通路的上游部位。为了验证HBsAg如何作用于PMA分化的THP-1细胞,通过逆转录病毒载体构建了能够稳定表达HBsAg的THP-1细胞系。稳定表达HBsAg的THP-1巨噬细胞中,JNK和p38信号通路的磷酸化也受到抑制,并且TLR4配体LPS诱导细胞产生的细胞因子减少。同时用表达HBsAg的转基因小鼠,分离小鼠腹腔巨噬细胞,发现转基因小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子IL-12的能力以及JNK信号通路的活化能力较野生型小鼠低。上述结果进一步证实HBsAg能够抑制巨噬细胞TLR4信号通路的活化。为进一步分析HBsAg抑制TLR4分子表达和信号通路活化的分子机制,对HBsAg的内吞与信号通路抑制间的因果关系进行了验证。用Alexa Flour488标记自病人血清中纯化的HBsAg,共聚焦显微镜和流式细胞术证实HBsAg能被PMA分化的THP-1巨噬细胞所吞噬,并定位于巨噬细胞溶酶体中。用内体酸化抑制剂Bafilomycin A1抑制溶酶体成熟后,HBsAg进入细胞的比例显著减少,并能部分回复HBsAg对JNK信号通路的抑制作用,提示HBsAg对巨噬细胞TLR4信号通路的抑制作用可能与其被吞噬有关。由于HBsAg能被巨噬细胞吞噬,并且有文献报道定位于晚期内体溶酶体中的Rab7b分子能负调TLR4分子的表达,因此推钡HBsAg内吞、Rab7b分子表达与TLR4表达下降这三者间存在一定的关系。进一步的实验结果显示,HBsAg预处理PMA分化后的THP-1细胞后,能够上调定位在晚期内体的Rab7b mRNA水平,但是不影响定位在早期内体的Rab5的RNA水平,提示HBsAg通过内吞入胞而上调Rab7b表达,这可能是HBsAg抑制TLR4表达并进一步抑制TLR4信号通路的机制之一。综上所述,本研究表明乙型肝炎病毒表面抗原可以抑制巨噬细胞TLR4下游JNK/p38信号通路的磷酸化以及细胞因子IL-12的产生,这种抑制作用可能与HBsAg被内吞后上调定位在晚期内体溶酶体的Rab7b分子相关。本研究结果部分阐述了乙型肝炎病毒感染慢性化的机制,即乙型肝炎病毒利用HBsAg削弱天然免疫系统中抗原递呈细胞的功能,而建立慢性持续性感染,为探索慢性乙型肝炎治疗的新方法提供了新的理论基础和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 一、主要仪器和设备
• 二、实验方法和材料
• 结果
• 讨论
• 论文小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢