大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物的增量研究

论文摘要

大叶白麻（ Poacynum hendersonii （Hook. f.）Woodson）属夹竹桃科（Apocynaceae）白麻属（ Poacynum Baill）的一种多年生草本植物。本文研究目的是如何利用大叶白麻愈伤组织来生产三萜类化合物。首先,以大叶白麻下胚轴为外植体,摸索了诱导愈伤组织的基本条件及不同激素水平的愈伤组织生长状况;建立了HPLC法测定大叶白麻愈伤组织中熊果酸、齐墩果酸含量的方法,采用L9（34）正交试验设计方案优化了大叶白麻愈伤组织中熊果酸、齐墩果酸的提取工艺;以MS+ 6-BA 0.2 mg/L +NAA0.6 mg/L为基本培养基,研究了不同外植体、培养天数、继代次数、光周期、培养基碳源和添加物对大叶白麻愈伤组织增长倍数和三萜类化合物积累的影响;利用滤纸贴片法和试管MIC法分别测定了大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物对大肠杆菌（Escherichia coli）,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉（Penicillium chrysogenum）的抑菌作用。具体结果如下:1.以大叶白麻的下胚轴为材,在MB+NAA0.6 mg/L+6-BA0.6 mg/L、MB+NAA0.6 mg/L+6-BA0.2 mg/L和MB+NAA0.2 mg/L+6-BA0.6 mg/L三种培养基上愈伤组织诱导率均达到90 %以上。而培养基MB+NAA0.6 mg/L+6-BA0.2 mg/L比较适于愈伤组织的扩增2.用高效液相色谱法分析三萜类提取液,色谱柱为C18-ODS柱（150 mmx4.6mm）,柱温25℃,检测波长为215 nm,流动相为甲醇-0.1%磷酸（85:15, v/v）,流速为0.6 mL/min时有较好的分离效果,熊果酸浓度在0.08-0.40 mg/mL范围内与峰面积呈线性关系,回归方程为Y=584410X+230003（r=0.9998）;齐墩果酸浓度在0.12-0.60 mg/mL范围内与峰面积呈线性关系,回归方程Y=9870608X+165283（r=0.9997）。齐墩果酸和熊果酸保留时间分别为24.245和25.316分钟,分离度为1.52,可满足定性鉴定和定量分析的要求。大叶白麻愈伤中三萜类化合物最佳提取工艺为:用甲醇70℃回流提取1.0 h,料液比为1:16。提取溶媒对提取影响最大,其次为温度、提取用量,影响最小的是提取时间。在最佳提取条件下,测得熊果酸和齐墩果酸平均含量分别为1.2 mg/g和3.4 mg/g。3.考察单一培养条件对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合物积累的影响如下:（1）不同外植体诱导的愈伤组织对愈伤组织生长和三萜类化合物的产量影响差异较大。其中以下胚轴来源的愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量最大,分别达到7.4倍和5.2 mg/g;（2）愈伤组织在培养的第20 d增长倍数和三萜类化合物产量均达到最大值,分别为7.2倍和5.6 mg/g;（3）愈伤组织在第3代时增长倍数最大,三萜类化合物的产量达最大值,分别为7.3倍和5.4 mg/g;（4）四种光周期处理中,16 h光/d下的愈伤组织增长量和三萜类化合物产量最高,分别达到为7.2倍和5.2 mg/g ;（5）蔗糖比葡萄糖、果糖更有利于愈伤组织的生物量增长和三萜类化合物的积累,以附加5 %蔗糖最佳,分别为8.3倍和7.2 mg/g;（6）在三种含添加物的培养基中,以添加2 mg/L水杨酸的培养基上愈伤组织增长量最大,三萜类化合物产量也最高,分别为7.2倍和6.8 mg/g。综合以上各最佳培养条件的培养基,愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量分别为8.3倍和7.6 mg/g。4.大叶白麻愈伤三萜提取液对各菌种的抑菌效果如下:金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>青霉>黑曲霉。在本实验条件下,该三萜物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.91、1.82和3.65mg/mL,对黑曲霉和青霉的最小抑菌浓度均为7.31 mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 大叶白麻研究概况
• 1.1 大叶白麻的生物学特征
• 1.2 大叶白麻在生产实践上的应用
• 1.2.1 药用和保健价值
• 1.2.2 生态上的应用
• 1.2.3 纺织工业价值
• 2 三萜类化合物研究进展
• 2.1 三萜类化合物的分类
• 2.2 三萜类化合物的合成机制
• 2.3 理化性质
• 2.3.1 溶解度
• 2.3.2 颜色反应
• 2.4 三萜类化合物的生物活性
• 2.4.1 肝损伤的保护作用
• 2.4.2 抗菌和抗病毒活性
• 2.4.3 抗肿瘤活性
• 2.4.4 免疫调节作用
• 2.4.5 对心血管系统的作用
• 2.4.6 抗生育作用
• 2.5 三萜类化合物的提取及测定
• 2.5.1 三萜类化合物的提取技术
• 2.5.2 三萜类化合物的分离精制技术
• 2.5.3 三萜类化合物的测定
• 3 组织培养技术对三萜类化合物增量的研究进展
• 3.1 影响组织培养生产三萜类化合物的因素
• 3.1.1 外植体
• 3.1.2 碳源种类和浓度
• 3.1.3 植物生长调节剂
• 3.1.4 光照
• 3.1.5 添加物
• 4 本研究的内容与意义
• 4.1 本研究的内容
• 4.2 本研究的意义
• 第二部分 实验部分
• 第一章 大叶白麻愈伤组织的诱导与扩增
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 愈伤组织的诱导
• 2.2 不同激素组合对大叶白麻愈伤组织扩增的影响
• 3 讨论
• 第二章 提取方法对大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物提取的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试药
• 1.2 材料
• 1.3 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 精密度试验
• 2.2 稳定性试验
• 2.3 重现性试验
• 2.4 加样回收率试验
• 2.5 样品测定
• 2.6 提取正交验证试验
• 3 讨论
• 第三章 培养条件对大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物积累的影响
• 1 仪器、材料与方法
• 1.1 主要试验仪器与试剂
• 1.2 试验材料
• 1.3 试验设计
• 1.4 标准曲线的绘制
• 1.5 愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的测定
• 1.6 三萜类化合物的定性反应
• 2 结果与分析
• 2.1 不同外植体对愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的影响
• 2.2 培养时间对愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的影响
• 2.3 继代次数对愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的影响
• 2.4 光周期条件对愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的影响
• 2.5 碳源种类及蔗糖浓度对愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的影响
• 2.6 不同添加物对愈伤组织增长倍数和三萜类化合物产量的影响
• 2.7 三萜类化合物的定性反应试验结果
• 3 讨论
• 第四章 大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物的抑菌活性
• 1 仪器与试剂药品
• 1.1 实验仪器及用具
• 1.2 实验药品及试剂
• 2 材料与方法
• 2.1 供试菌种
• 2.2 测试样品
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 培养基配制
• 2.3.2 无菌滤纸片和无菌水的制备
• 2.3.3 菌种分离、纯化
• 2.3.4 菌悬液制备
• 2.3.5 三萜类化合物抑菌活性实验
• 2.3.6 最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 3 结果与分析
• 4 结论与讨论
• 图版说明
• 第三部分 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢