论文摘要
禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）引起的一种常见的重要细菌性传染病,且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染,给世界范围内养禽业造成了巨大的经济损失。研究发现,与禽大肠杆菌毒力相关的致病因子主要有: I型菌毛、P型菌毛、卷曲菌毛、铁转运系统、K抗原、补体抗性等。在上述大肠杆菌诸多致病因子中,菌毛对病原性大肠杆菌在易感动物机体内的入侵、定居、增殖或释放毒力因子的感染和致病过程中起着重要的作用。95%鸡致病性大肠杆菌菌株均可表达I型菌毛,I型菌毛是菌体复合蛋白,由主要结构亚单位FimA和3个次要亚单位FimF、FimG及FimH组成。在I型菌毛的组成中,位于菌毛顶部的粘附蛋白FimH,是I型菌毛和D-甘露糖受体特异性结合的粘附素（adhesin）,因此I型菌毛又称甘露糖敏感性菌毛。为探讨I型菌毛特别是FimH在禽大肠杆菌病发病过程中起的作用,基于禽大肠杆菌I型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体Red重组系统对禽致病性大肠杆菌国内分离株A2（血清型O2:K89）、CE128（血清型O78:K89）、CE129（血清型O1:K89）和1株禽源非致病性大肠杆菌C1（健康雏鸡肠道分离株,血清型未鉴定）I型菌毛上的黏附素fimH基因进行敲除。其主要构建步骤为:首先PCR扩增出两翼与fimH基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,然后转化入A2、CE128 CE129和C1,在Red重组系统表达重组酶的帮助下,含氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的fimH基因同源序列与禽大肠杆菌染色体上的fimH基因发生同源重组,通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过第二次重组去除抗性基因,结合PCR扩增和测序鉴定,证明△fimH突变株A2△fimH、CE128△fimH、CE129△fimH、C1△fimH正确构建。由于△fimH突变株染色体上的fimH基因序列大部分已缺失,从而造成回复突变的可能性不大。基于4株△fimH突变株构建的基础上,比较分析了4株△fimH突变株和其野生菌株的体外细胞粘附特性和其它部分相关生物学特性。通过豚鼠红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,所有野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖溶液完全抑制,而所有的△fimH突变株未呈现任何凝集现象,进一步通过fimH基因互补试验使△fimH突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性。豚鼠红细胞和酵母细胞凝集试验证明,FimH蛋白是I型菌毛和D-甘露糖受体特异性结合的粘附素,即I型菌毛为甘露糖敏感性菌毛。体外生长试验结果表明,△fimH突变株生长周期各个阶段都要稍慢于野生株。鸡嗜异性粒细胞和A549细胞（人肺上皮细胞）粘附试验表明,相对于野生菌与鸡嗜异性粒细胞和A549细胞粘附的数量来说,△fimH突变株少于野生株。利用λ噬菌体Red重组系统构建的△fimH突变株染色体上的fimH基因序列大部分已缺失。已构建的4株△fimH突变株与常规方法构建的突变株相比,其4株突变株仅仅缺失目的基因fimH但不含任何用于筛选的抗性标记基因,并能作为亲本株用于其它不同单基因或多基因的缺失构建。这些△fimH突变株的构建有望为进一步深入研究禽大肠杆菌I型菌毛与机体相互作用的分子机制以及FimH与宿主防御系统相关细胞的相互作用机制提供了一定的基础。
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