转rhG-CSF基因鱼腥藻的构建及其特性研究

论文摘要

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor, G-CSF）是一种由170 多个氨基酸构成的多肽,由人和哺乳动物细胞产生,作为造血生长因子,在临床上主要用于治疗肿瘤患者因放疗、化疗引起的中性粒细胞减少症。作为基因工程药物,近10 年来主要用大肠杆菌基因工程制备,下游纯化工艺复杂,成本高,且不稳定,要低温保存。蓝藻是一种结构简单的光合原核生物,具有分布广泛、适应性强、培养成本低、生长迅速等特点,且多数不含内毒素,不形成包含体,不需作变性、复性处理,是理想的转基因模式生物材料;近年来蓝藻基因工程发展迅速,已经形成了一套稳定的基因转化体系,可以有效地转化外源基因,并稳定表达;因此,蓝藻作为新的基因工程宿主细胞备受关注。陈翠丽等在利用蓝藻作为宿主转化hG-CSF 基因方面作了一些前期工作,两次改造G-CSF基因,但没有得到有效表达G-CSF 的转基因蓝藻。本研究的目的是将突变的G-CSF 基因转入蓝藻,并成功表达。如能得到rhG-CSF 表达量高的转基因藻,将为解决我国基因工程生产G-CSF 可能面临的知识产权纷争问题做出贡献,同时,也为将G-CSF 制成口服制剂做准备。主要研究结果如下: 1. 利用DNA 重组技术,在不改变阅读框的前提下,将hG-CSF 基因的前四个氨基酸的碱基作了部分改动,并插入到pUC-19 载体上,进而将连有rhG-CSF 基因的中间载体pUC-G-CSF 插入到蓝藻穿梭表达载体pRL-489 的启动子PpsbA的下游,构建穿梭表达载体pRL-G-CSF, 用于转化蓝藻。2. 丝状体蓝藻生长较快,对环境适应强,容易采收,本研究通过三亲接合转移方法,将构建的穿梭表达载体pRL-G-CSF 转入丝状体蓝藻鱼腥藻7120 内。得到有抗生素抗性的转rhG-CSF 基因的鱼腥藻7120-G-CSF。3. 转基因鱼腥藻在平板筛选后,转入液体筛选,并逐步提高抗生素浓度。提取质粒进行PCR 和酶切鉴定,证明存在600bp 的DNA片段。4. 利用酶联免疫方法,首次在转基因蓝藻中表达G-CSF 成功,目的蛋白占总可溶性蛋白的0.0409%。5. 通过对转基因鱼腥藻生长曲线、叶绿素含量及光合放氧的测定表明,该基因转入后,鱼腥藻的生长活性在培养的前中期有一定提高,当转基因鱼腥藻在培养液中生长20 天时,7120-489 和7120-G-CSF 的生长量分别是7120-W 的189%和178%。在光强为200μmol/m2s 时,转基因藻的光合放氧量大于野生藻的放氧量,7120-G-CSF 和7120-489

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 蓝藻基因工程
• 1.1.1 蓝藻及其特点
• 1.1.2 蓝藻基因工程技术
• 1.1.3 外源基因在蓝藻中的表达
• 1.2 粒细胞集落刺激因子的研究进展
• 1.2.1 G-CSF 的基本性质及研究进展
• 1.2.2 hG-CSF 药物制备
• 1.3 研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料和主要试剂
• 2.2 主要溶液的配制
• 2.3 感受态细菌的制备
• 2.4 质粒的提取和纯化
• 2.5 DNA 浓度的测定
• 2.6 PCR 扩增目的片段
• 2.7 酶切反应体系的建立
• 2.8 连接反应体系的建立
• 2.9 穿梭表达载体的构建、筛选和鉴定
• 2.10 蓝藻的培养、纯化及保种
• 2.11 三亲接合转移方法转化蓝藻
• 2.12 蓝藻质粒DNA 的检测
• 2.13 转基因蓝藻总蛋白含量测定
• 2.14 G-CSF 蛋白的含量测定
• 2.15 转基因藻的筛选和纯化
• 2.16 转基因藻的形态观察
• 2.17 转基因藻的生理活性检测
• 2.18 放氧光合活性的测定
• 第三章 穿梭表达载体的构建及转化鱼腥藻
• 3.1 中间载体的鉴定
• 3.2 G-CSF 基因序列测定
• 3.3 G-CSF 基因表达产物的序列
• 3.4 穿梭表达载体的鉴定和正反连的筛选
• 3.5 载体pRL-G-CSF 对鱼腥藻的转化
• 3.6 转基因鱼腥藻的筛选
• 3.7 转基因鱼腥藻中目的基因的PCR 检测
• 3.8 转基因鱼腥藻质粒酶切检测
• 3.9 转基因鱼腥藻蛋白检测
• 3.10 讨论
• 第四章 转基因藻的筛选及其生理学特性研究
• 4.1 转基因藻的筛选和纯化
• 4.2 转基因藻的形态观察
• 4.3 生长曲线及叶绿素含量
• 4.4 光合放氧曲线
• 4.5 讨论
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介