产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究

论文摘要

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物,具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用,一直都受到各国的关注;其中寄生曲霉的所有菌株都能产生黄曲霉毒素而黄曲霉只有部分菌株能产生黄曲霉毒素;据FAO报道,全球每年约有25%的农作物遭受霉菌及其毒素的污染,约有2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。但国内外研究的焦点主要集中在黄曲霉毒素的检测方法,而对产黄曲霉毒素菌株检测的方法报道较少;传统的微生物检测方法费时、费力而且容易出现假阴性结果,给检测带来误差。目前对于被黄曲霉毒素污染的粮食只是被动地采用减毒化处理,并没有真正从产毒菌株这一源头上进行有效防控,其主要原因在于对毒素产生菌的产毒机制、产毒条件和毒素积累规律缺乏深度了解,缺少可用于指导防控实践的理论依据。本文研究了3种不同的方法检测产黄曲霉毒素的菌株,同时对产毒菌株的产毒条件和毒素积累规律进行了摸索,实验模拟了粮食储藏环境,确定产毒的最优条件和最低条件,通过对黄曲霉产毒条件和毒素积累规律的研究不仅可以确定影响毒素产量的主要环境因素,而且还可以预测出在自然环境中菌株的产毒情况,从而为揭示其产毒机制并进一步制定出相应的防控措施提供依据。主要研究结果如下:1.在毒素提取方法上参考中华人民共和国国家标准并加以改进,确定了发酵液中黄曲霉毒素的提取方法,采用免疫亲和柱法进行纯化处理实现了黄曲霉毒素的有效分离并减少了其它毒素的干扰;再经过柱后电化学衍生增大荧光强度进行荧光检测,实现快速、准确检测黄曲霉毒素;因此可以定性、定量的检测产黄曲霉毒素菌株。2.利用环糊精可以增强黄曲霉毒素荧光强度这一特性,在普通霉菌培养基中添加β-环糊精和Mβ-环糊精,在本实验条件下,通过对β-环糊精和Mβ-环糊精作用效果、添加浓度的比较,确定了Mβ-环糊精添加浓度为6g/L时对增强黄曲霉毒素荧光效果较好;同时,对Mβ-环糊精增强黄曲霉毒素荧光的特异性做了分析,结果表明Mβ-环糊精只能增强黄曲霉毒素的荧光性。该方法在普通霉菌培养基上都适用,这与传统的检测方法相比要简单、快速,且节省人力、物力。3.通过对黄曲霉毒素合成过程中重要的几个结构基因的筛选,发现aflO、aflD和aflP这三个基因是黄曲霉毒素合成过程中的关键基因,这三个基因同时表达的菌株经HPLC检测都是产黄曲霉毒素菌株,因此可以通过RT-PCR的方法检测这三个基因是否同时表达可以推断出该菌株是否是产毒菌株或其是否具有产毒的可能性。4.通过正交试验确定了产毒菌株的最适产毒条件和最低条件;实验利用温度、PH、转速来模拟粮食的储藏环境,实验表明,通过控制改变储藏环境条件来控制产毒菌的产毒是一个高效易行的方法;储藏环境中的通风条件,储藏环境温度和储藏物的pH对菌株的产毒影响重大,较低的温度和良好的通风,即一个凉爽干燥的储藏环境,加上弱碱性的条件pH值可以很好的降低毒素的产量。5.本文同时还对黄曲霉菌株和寄生曲霉菌株的毒素积累规律做了研究,在最优培养条件下,黄曲霉毒素的产生量在短时间内迅速增加;通过对黄曲霉产毒条件的研究不仅可以预测出在自然环境中菌株的产毒情况,而且还可以确定影响毒素产量的主要环境条件等,从而为揭示其产毒机制并进一步制定出相应的防控措施提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 研究现状
• 1.1.1 黄曲霉毒素的简介
• 1.1.2 黄曲霉毒素性质及毒性
• 1.1.3 黄曲霉毒素的检测方法
• 1.1.4 黄曲霉毒素的生物合成过程及其代谢途径
• 1.1.5 PCR 及反转录 PCR（RT-PCR）技术
• 1.1.6 黄曲霉毒素污染控制的发展
• 1.2 研究的内容和意义
• 1.2.1 研究内容
• 1.2.2 研究意义
• 参考文献
• 2. 利用 HPLC 法检测产黄曲霉毒素的菌株
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株培养方法
• 2.2.2 黄曲霉毒素提取方法
• 2.2.3 色谱条件
• 2.2.4 样品检测
• 2.2.5 混合标准品的检测
• 2.2.6 混合标准品液相色谱标准曲线制定
• 2.2.7 加标回收率和方法精密度
• 2.2.8 最低检出限
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 混合标准品色谱图
• 2.3.2 发酵液样品 HPLC 图
• 2.3.3 标准曲线的制定
• 2.3.4 加标回收率、方法精密度和最低检出限
• 2.3.5 实验菌株产黄曲霉毒素能力的分析
• 2.4 本章小结
• 2.4.1 黄曲霉毒素的提取
• 2.4.2 衍生方法的选择
• 参考文献
• 3. 一种简单快速筛选产黄曲霉毒素菌株的方法
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株培养方法和结果观察
• 3.2.2 添加不同浓度的环糊精对黄曲霉毒素荧光强度的影响
• 3.2.3 甲基化β-环糊精对增强黄曲霉毒素荧光作用的特异性分析
• 3.2.4 不同霉菌培养基中添加甲基化 β-环糊精的效果
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基中添加环糊精的作用
• 3.3.2 培养基中添加β-环糊精（β-cyd）和甲基化β-环糊精（Mβ-cyd）效果的比较
• 3.3.3 环糊精对黄曲霉毒素荧光增强作用的特异性分析
• 3.3.4 不同霉菌培养基添加环糊精后的效果
• 3.3.5 甲基化β-环糊精（Mβ-cyd）对产毒菌株生长的影响
• 3.3.6 培养温度的影响
• 3.3.7 培养时间的影响
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 4. 反转录 PCR（RT-PCR）方法筛选产黄曲霉毒素菌株
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 仪器与设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验耗材处理
• 4.2.2 菌株的培养
• 4.2.3 菌丝体 DNA 和 RNA 的提取
• 4.2.4 cDNA 第一链的合成
• 4.2.5 实验所用引物
• 4.2.6 PCR 反应程序
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 RNA 的提取
• 4.3.2 PCR 和 RT-PCR 结果
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 5. 产黄曲霉毒素菌株黄曲霉毒素积累规律的研究
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 实验菌株
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 仪器与设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 菌株培养及菌悬液制备
• 5.2.2 孢子浓度的测定
• 5.2.3 毒素提取及检测方法
• 5.2.4 无机盐对发酵的影响
• 5.2.5 培养条件的优化
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 接种量对黄曲霉毒素毒素产生量的影响
• 4）₂SO₄和 ZnSO₄对黄曲霉毒素毒素产生量的影响'>5.3.2 （NH₄）₂SO₄和 ZnSO₄对黄曲霉毒素毒素产生量的影响
• 5.3.3 不同温度对黄曲霉毒素毒素产生量的影响
• 5.3.4 不同 PH 对毒素产生量的影响
• 5.3.5 摇床转速（通氧量）对毒素产生量的影响
• 5.3.6 菌株产毒的最优条件和最低条件
• 5.3.7 黄曲霉毒素积累规律的摸索
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 6. 结论
• 致谢