含铬或锰的新型固氮酶的纯化，特性和结晶——棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究

论文题目: 含铬或锰的新型固氮酶的纯化，特性和结晶——棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 赵颖

导师: 黄巨富

关键词: 棕色固氮菌突变种,蛋白,蛋白,蛋白质纯化,特性和结晶

文献来源: 中国科学院研究生院（植物研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 以含MnSO4或Na2CrO4的无钼无氨的修改Burk’s培养基,培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann）突变种UW3,发现在一定浓度范围内, MnSO4或Na2CrO4的加入有助于促进其生长.菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明,这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo,参与组装固氮酶中心原子簇,从而影响固氮活性而实现的. 利用阴离子交换（DEAE-52和Q-Sepharose FF）和凝胶过滤（Sephacryl S-200）柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分Ⅰ蛋白（分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白）,并对其进行了特性研究.厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE结果显示, 两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体.亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应,分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基. CrFe蛋白的C2H2还原活性, Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36%, 38%和43%,而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50%左右,并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率. 对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr,但仍存在少量Mo污染.与OP MoFe蛋白相比,这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率（[θ]）除在450nm较接近外,在可见光区的其它波长处均显著降低.与DT还原OP MoFe蛋白相似, CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4.3、3.7和2.0的特征EPR信号,但各处信号强度比例不同.在对污染Mo可能引起的信号进行校正后,CrFe蛋白的三个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20%, 0%和10%,而MnFe蛋白则分别相当于112%, 49%和65%.上述结果表明, CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco （M=Cr, Mn或Mo）的M种类,而P-cluster结构和组成均未见大的差异. 利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化,确定了以Tris/Hepes, NaCl, MgCl2和PEG 8000为主要变量的沉淀剂体系,寻找各组分对于晶体生长的最适浓度.以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化.在一定条件下,两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶. 对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示,晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成.通过“神舟三号”飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响,结果表明,微重力有助于避免孪晶形成,并具有长期

论文目录:

摘要

Abstract

缩略语表

第一章 前言

1.1 固氮酶生物化学研究

1.1.1 第一套固氮酶体系——含钼固氮酶

1.1.1.1 含钼固氮酶的组成

1.1.1.2 底物还原特性

1.1.1.3 稳定性与保护机制

1.1.1.4 金属原子簇的波谱学研究

1.1.2 非钼固氮酶

1.1.2.1 第二套固氮酶体系——含钒固氮酶

1.1.2.2 第三套固氮酶体系——仅含铁的固氮酶

1.1.3 第三种替代固氮酶体系——嗜热自养链霉菌中的耐氧固氮酶

1.2 固氮酶的分子生物学研究

1.2.1 固氮基因的定位

1.2.2 固氮酶结构基因

1.2.3 金属原子簇合成相关基因

1.2.4 固氮酶调控基因

1.3 其它可能存在的固氮酶体系

1.3.1 钨铁蛋白

1.3.2 可能存在的新型固氮酶——含铬或含锰的固氮酶

1.4 固氮酶晶体学研究

1.4.1 固氮酶组分蛋白的结晶研究

1.4.2 固氮酶晶体学研究进展

1.4.2.1 Fe 蛋白

1.4.2.2 MoFe 蛋白

1.4.2.3 固氮酶复合体

1.5 选题依据及研究思路

第二章 材料与方法

2.1 菌种及培养

2.1.1 菌种

2.1.2 培养基配制

2.1.2.1 母液的配制

2.1.2.2 应用液的配制

2.1.3 菌体培养

2.1.3.1 菌种活化

2.1.3.2 摇瓶扩大培养

2.1.3.3 小罐发酵

2.1.3.4 菌体收集

2.1.4 菌体生长及活性曲线制作

2.1.4.1 菌体生长曲线

2.1.4.2 整体菌活性曲线

2.2 厌氧技术

2.2.1 除氧溶液的配制

2.2.2 氩气中含有的微量氧气的去除

2.2.3 厌氧操作要点

2.3 固氮酶提取及纯化

2.3.1 缓冲液的准备

2.3.2 固氮酶的提取与纯化

2.3.2.1 野生种OP固氮酶MoFe蛋白和Fe蛋白的提取与纯化

2.3.2.2 突变种UW3/Cr固氮酶CrFe蛋白的提取与纯化

2.3.2.3 突变种UW3/Mn固氮酶MnFe蛋白的提取与纯化

2.4 蛋白质浓度测定

2.4.1 试剂配制

2.4.2 标准曲线制作

2.4.3 样品蛋白浓度测定

2.5 固氮酶活性测定

2.5.1 MgATP 发生系统的配制

2.5.2 固氮酶MFe 蛋白活性测定

2.6 蛋白质电泳及Western blotting (免疫印迹)

2.6.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

2.6.1.1 电泳试剂的配制

2.6.1.2 SDS-PAGE 制胶及电泳

2.6.2 厌氧天然PAGE

2.6.3 免疫印迹

2.6.3.1 试剂的配制

2.6.3.2 转印步骤

2.6.3.3 显色

2.7 蛋白质样品中的金属含量测定

2.7.1 Mn, Cr, Mo, Fe 混标溶液的配制

2.7.2 蛋白质样品的硝化

2.7.3 金属含量的测定

2.7.3.1 标准曲线制作

2.7.3.2 样品中金属浓度的测定

2.7.3.3 金属含量计算

2.8 蛋白质圆二色(CD) 谱的测定

2.8.1 可见光区CD 谱

2.8.2 远紫外区CD 谱

2.9 蛋白质电子顺磁共振(EPR) 谱

2.10 蛋白质结晶

2.10.1 溶液配制

2.10.1.1 母液配制

2.10.1.2 沉淀剂配制

2.10.2 结晶方法

2.10.3 培养及观察

2.10.4 晶体的电泳鉴定

2.10.5 空间微重力对结晶的影响

第三章 结果与讨论

3.1 棕色固氮菌突变种UW3 的生长特性

3.1.1 UW3/Mn 的生长特性

3.1.2 UW3/Cr 的生长特性

3.2 固氮酶组分蛋白的纯化

3.2.1 CrFe 蛋白和MnFe 蛋白的分离纯化

3.2.2 CrFe 蛋白和MnFe 蛋白制备物的电泳行为及其组分鉴定

3.2.2.1 CrFe 蛋白和MnFe 蛋白的电泳行为

3.2.2.2 制备物蛋白组分鉴定

3.3 CrFe 蛋白和MnFe 蛋白的特性研究

3.3.1 底物还原特性

3.3.2 金属含量分析

3.3.3 光谱及波谱特性

3.3.3.1 CD 谱

3.3.3.2 电子顺磁共振谱

3.4 CrFe 蛋白和MnFe 蛋白结晶研究

3.4.1 沉淀剂对气相扩散法结晶的影响

3.4.1.1 缓冲体系的影响

3.4.1.2 PEG 8000 的影响

3.4.1.3 无机盐的影响

3.4.2 结晶方法的影响

3.4.3 液-液扩散法对MnFe 蛋白和CrFe 蛋白大单晶的培养

3.4.3.1 PEG 的选择

3.4.3.2 无机盐的影响

3.4.3.3 蛋白质晶体的电泳鉴定

3.4.4 空间微重力下的CrFe 蛋白和MnFe 蛋白晶体生长

3.4.4.1 厌氧条件对固氮酶结晶的重要性

3.4.4.2 MnFe 蛋白气相扩散坐滴法沉淀剂的选择

3.4.4.3 空间微重力对MnFe 蛋白和CrFe 蛋白结晶的影响

第四章 本研究主要进展与展望

4.1 主要进展

4.2 本研究的创新点

4.3 研究展望

参考文献

研究生期间参与发表的论文

致谢

发布时间: 2006-04-30

参考文献

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