高产胞外多糖嗜酸乳杆菌筛选、发酵条件优化及多糖结构分析

论文摘要

多糖（polysaccharide）是由多个单糖分子缩合、失水而成,符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物。细菌多糖主要以三种形式存在:胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。胞内多糖主要是以糖原形式存在,起到储存能量的作用。胞壁多糖是维持细胞形态的结构性多糖,其主要成分是多糖类物质和蛋白质与脂类相结合形成的,如肽聚糖、脂多糖和磷壁酸等。广义上的胞外多糖指的是糖被（glycocalyx）,其主要作用是起到保护细菌免受缺水、宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢产物和表面吸附的作用。包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团。狭义上的胞外多糖指的是黏液层,即是一种扩散到培养基中的多糖物质,也是人们通常所说的胞外多糖。乳酸菌是人体肠道内定植的一类固有益生菌,是一类能发酵利用碳水化合物并产生大量乳酸的细菌。美国FDA已经确认其为对人体安全的发酵菌种。其中嗜酸乳杆菌是人体肠道内的优势菌群之一。嗜酸乳杆菌是历史悠久的工业发酵菌种,其在应用上已具有比较明显的优势。嗜酸乳杆菌胞外多糖不仅对乳制品的质构和风味具有重要影响,而且有可能成为食品级多糖的一个极好的来源而广泛应用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及保湿。目前国内外对于细菌多糖的研究比较深入,但是乳酸菌胞外多糖的研究才刚刚起步,一些乳酸菌多糖的结构和生物活性功能还没有得到确定和证实。乳酸菌的发酵条件和产多糖的环境因素影响还有待探讨。本文以嗜酸乳杆菌为研究对象,对其产多糖的条件和影响因素进行了初步探讨;研究了在特定的环境下,嗜酸乳杆菌产的胞外多糖提取工艺、分离纯化以及结构鉴定;通过生物学的方法进行诱变育种以筛选高产胞外多糖的菌株;通过发酵条件的优化得到理想产量的嗜酸乳杆菌胞外多糖,为达到能够实现工业化生产的目的提供理论基础。采用镜检观察所选菌株的形态特征的方法从市售酸奶中分离出疑似菌株,通过明胶液化、接触酶反应、硝酸盐还原、吲哚以及硫化氢反应确定乳杆菌属。最后通过糖发酵实验和16sDNA鉴定确定嗜酸乳杆菌并通过化学诱变的方法筛选得到高产胞外多糖的嗜酸乳杆菌菌株,最高产量达到6.46g/L。采用不同的发酵条件进行发酵,检测其胞外多糖的产量。利用Placket-Burman（非对称二元设计）对影响产量的16个因素进行分析得出对其发酵影响最大的3个因素;然后通过快速响应曲面的方法对其发酵条件进行优化,使得胞外多糖产量达到3.85g/L发酵液经酒精沉淀4℃浸提过夜。以酒精浓度、料液比、浸提时间分别为影响因子进行三元二次旋转正交实验得出嗜酸乳杆菌胞外多糖的最佳提取工艺是:80%酒精浓度下,以1:1.8的料液比抽提12h,胞外多糖产量达到1.91 g/L。将上述各优化条件结合起来进行多糖发酵实验分别得到产量为8.5g/L、8.7g/L和8.1g/L,比原来产量提高462%。远远高于国内报道产量,接近国际报道产量。将得到的沉淀物用蒸馏水复溶透析48h之后冷冻干燥。然后分别用DEAE-Cellulose52和Sephadex G-200进行纯化得到带电荷的最大分子量级份以备结构分析。利用傅立叶红外和气相分析仪测定了嗜酸乳杆菌胞外多糖的分子结构和多糖组成成分,同时利用扫描电镜观察多糖结构。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1. 课题研究背景
• 2. 乳酸菌胞外多糖的研究进展
• 2.1 乳酸菌胞外多糖培养条件优化的研究进展
• 2.2 高产胞外多糖的微生物诱变研究进展
• 2.3 乳酸菌胞外多糖的提取工艺研究进展
• 2.4 乳酸菌胞外多糖结构的研究进展
• 2.5 乳酸菌胞外多糖功能活性的研究进展
• 2.6 本实验的目的和内容
• 第二章 嗜酸乳杆菌分离筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 培养基
• 1.5 实验试剂溶液的配制（赵斌等，2002）
• 1.6 实验方法
• 2 结果分析
• 2.1 菌体形态染色观察
• 2.2 生理生化鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于培养基
• 3.2 关于糖发酵
• 3.3 关于菌株的鉴定
• 第三章 高产胞外多糖的嗜酸乳杆菌诱变筛选
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜酸乳杆菌诱变剂量的选择
• 2.2 高产胞外多糖嗜酸乳杆菌突变株的初筛
• 2.3 高产菌株的复筛
• 2.4 突变菌株的稳定性检测
• 3 讨论
• 3.1 关于诱变方法
• 3.2 关于多糖含量和粘度
• 3.3 关于突变株稳定性
• 第四章 嗜酸乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 利用Placket-Burman对胞外多糖产量影响最大的因素筛选
• 2.2 快速爬坡实验
• 2.3 响应曲面实验分析
• 3 讨论
• 3.1 关于胞外多糖产量的影响因素
• 3.2 关于胞外多糖产量的优化方法
• 第五章 嗜酸乳杆菌胞外多糖的提取工艺优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 葡萄糖标准曲线
• 2.2 嗜酸乳杆菌胞外多糖提取单因素实验
• 2.2.1 料液比对嗜酸乳杆菌胞外多糖提取的影响
• 2.2.2 时间对嗜酸乳杆菌胞外多糖提取的影响
• 2.2.3 酒精浓度对胞外多糖的提取影响
• 2.3 旋转正交优化提取工艺优化
• 3 讨论
• 3.1 关于胞外多糖的提取方法
• 3.2 关于多糖提取工艺优化的方法
• 3.3 关于流体特性对于提取效果的影响
• 3.4 关于分离方法
• 3.5 关于多糖的检测方法
• 第六章 嗜酸乳杆菌胞外多糖的各级分纯化和结构鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果分析
• 2.1 离子交换层析
• 2.2 G-200凝胶过滤层析
• 2.3 嗜酸乳杆菌胞外多糖电镜照片
• 2.4 嗜酸乳杆菌胞外多糖级份A红外光谱分析
• 2.5 级份A的气相分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢