嗜水气单胞菌aopB-/aopD-Ah2056株的构建

论文摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种人畜共患的病原菌,也是一种食源性病原菌。特别是嗜水气单胞菌引起的水生动物细菌性败血症,是我国水产养殖史上危害最大、造成的经济损失最严重的一种急性传染病。在现阶段预防和控制该病的主要措施是利用细菌灭活疫苗免疫接种和使用抗菌药。灭活疫苗能够降低死亡率,不能降低其发病率,也不能对异源血清型菌的感染提供较好的交叉保护,抗菌药又存在抗药性和药物残留问题。与灭活疫苗不同,弱毒疫苗能够重复提呈抗原和诱导机体产生持续性免疫应答和保护,因此,通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已是国内外疫苗研究的热点之一。本研究以本地分离的Ah2056菌株为亲本,构建了AhaopB-/aopD-基因缺失株。主要工作如下:1.Ah2056亲本株的鉴定参照GenBank中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,从本地分离的嗜水气单胞菌基因组中扩增16SrRNA片段,连接到克隆载体pMD18T上,筛选阳性克隆,测序,绘制系统进化树进行分类。2.重组自杀性质粒pRE aopB-/aopD-的构建参照GenBank中嗜水气单胞菌aopB/aopD序列,从Ah2056基因组中扩增aopB/aopD上、下游片断,以pBluescriptⅡSK为中间转移载体连接到自杀性质粒pRE112上,构建了缺失369bp的aopB-/aopD-基因并含有蔗糖敏感基因（sacB）的重组自杀性质粒pRE aopB-/aopD-。3.aopB-/aopD-基因缺失株的的构建首先以重组自杀性质粒pRE aopB-/aopD-转化大肠杆菌X7213,再以大肠杆菌X7213阳性克隆为供体菌,与受体菌Ah2056进行接合转移,经涂布氯霉素（Cm）抗性平板并转印到含10%蔗糖的平皿,筛选出Cm抗性（CmR）蔗糖敏感（SucS）的接合子,并用PCR鉴定重组自杀性质粒己经整合到染色体中。阳性接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组。再涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平板上,筛选出Cm敏感（CmS）蔗糖抗性（SucR）的克隆,并用PCR鉴定,证实了第二次交换,从而构建了aopB-/aopD-基因缺失株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 嗜水气单胞菌的概述
• 1.2 嗜水气单胞菌的毒力因子
• 1.2.1 嗜水气单胞菌胞外分泌物
• 1.2.2 嗜水气单胞菌的结构蛋白及内毒素
• 1.3 嗜水气单胞菌的外膜蛋白与aopB/aopD基因
• 1.4 细菌基因缺失突变体的构建与筛选方法
• 1.4.1 正向筛选方法
• 1.4.2 负向筛选方法
• 1.4.3 正负双向筛选系统的重组机制
• 2 研究的目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 质粒、菌株
• 3.1.2 工具酶、试剂
• 3.1.3 主要培养基
• 3.1.4 常用溶液的配制
• 3.1.5 引物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 嗜水气单胞菌基因组DNA提取
• 3.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.4 连接与转化
• 3.2.5 质粒的小量制备（碱裂解法）
• 3.2.6 重组质粒的快速鉴定
• 3.2.7 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.8 嗜水气单胞菌的PCR鉴定
• 3.2.9 嗜水气单胞菌Ah2056株aopB/aopD上下游片段的克隆与鉴定
• 3.2.10 中间转移质粒pSKaopB/aopD12的构建
• 3.2.11 重组自杀性质粒pREaopB/aopD12的构建
• -/aopD^-缺失株的筛选鉴定'>3.2.12 接合转移与AhaopB^-/aopD^-缺失株的筛选鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 嗜水气单胞菌16SrRNA基因的克隆与序列分析
• 4.2 aopB/aopD基因上下游片段的扩增
• 4.3 aopB/aopD上下游片段的重组质粒的构建及测序
• 4.4 重组质粒pSKaopB/aopD1的构建及鉴定
• 4.5 重组质粒pSKaopB/aopD12的构建及鉴定
• 4.6 重组自杀性质粒pREaopB/aopD12的构建及鉴定
• -/aopD^-缺失株的筛选与鉴定'>4.7 AhaopB^-/aopD^-缺失株的筛选与鉴定
• 5 讨论
• 5.1 致病菌的鉴定
• 5.2 aopB/aopD基因的选择
• 5.3 缺失株的筛选鉴定
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢