活性氧在人脐静脉内皮细胞衰老中的作用和睾酮的干预研究

论文摘要

背景和目的:随着年龄的增长,血管壁的结构和功能会发生重大变化,包括血管腔扩大,血管内膜和中层增厚,血管僵硬度增加,部分血管壁细胞衰老,还有代表血管内皮功能的内皮依赖性血管舒张功能减弱,这些变化改变了各种心脑血管疾病的病理生理机制,从而改变了疾病发生的阈值、严重程度和预后,可能是多种增龄相关性疾病,包括动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）形成的共同机制之一。血管内皮细胞位于血管腔内壁,维持着血管内皮的完整及其功能的正常。血管内皮不仅具有屏障功能,维持血流的通畅,还具有重要的内分泌功能,它可以通过膜受体感知血流动力学和血源性信号的变化,合成并分泌多种生物活性物质,对维护血管结构和功能的正常和凝血系统的稳定起着重要的作用。血管内皮功能障碍与诸多疾病的发生、发展密切相关,目前认为它是AS形成初始阶段的重要改变。近年来的研究表明,体外培养的衰老的血管内皮细胞会发生形态与功能的改变,表现为细胞肥大扁平,内源性一氧化氮分泌减少,呈现出促炎与促栓的表型,这或许在增龄相关的血栓栓塞性疾病中起着重要作用。氧化应激是经典的衰老机制学说之一。以往研究认为,活性氧簇（reactiveoxygen species,ROS）通过氧化应激导致细胞DNA损伤,DNA修复失代偿,引发一系列基因与蛋白的表达异常,细胞发生衰老。在AS发病机制研究中发现,ROS诱导一些炎症因子基因的表达独自或联合参与了AS的形成过程。随着年龄的增长,这些因素在血管壁所造成的损伤不断积累,很可能成为诱导血管衰老发生与发展的最重要因素之一,从而使老年人更容易发生AS。在增龄过程中,除了血管衰老本身因素之外,老年人易发AS的另一个具有老年人群特点的危险因素是体内随年龄增长而发生的性激素平衡的改变。在增龄过程中,体内性激素发生相应变化,其中性激素水平在更年期后发生的变化显示出性激素对机体作用的重要性。流行病学研究表明,男性40岁或50岁后,体内睾酮水平明显降低,而且,男性内源性睾酮水平与多种老年性疾病密切相关。男性内源性睾酮水平与男性血管结构随年龄增长发生的变化之间有无一定的联系呢?目前研究还较少。睾酮对血管内皮细胞衰老的影响,目前还没有文献报道,其作用机制也还没有明确。因此,我们使用低浓度过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）衰老,通过观察测定HUVECs在ROS的作用下各种衰老指标（细胞增殖能力、β-半乳糖苷酶的表达）、细胞内氧化应激水平以及细胞周期调控因子（去磷酸化Rb蛋白）的表达变化,探讨HUVECs衰老的机制,并予睾酮及性激素受体拮抗剂干预,探讨不同浓度睾酮对活性氧诱导HUVECs早衰的干预作用及其可能的作用机制,为明确睾酮在干预血管老化中的作用,及其作用机制提供新的理论和实验依据,或许能为增龄相关脉管系统疾病的防治提供新的靶点。方法:1、培养HUVECs,采用第4～6代细胞。使用60μmol/L H2O2作用72 h,诱导HUVECs发生衰老。2、分组:①正常对照组:给予低血清（2%）培养基;②H2O2对照组:给予低血清培养基+H2O2（60μmol/L）;③睾酮干预组:分别给予睾酮3nmol/L,30nmol/L,300nmol/L,3μmol/L培养30min后,再加予H2O2（60μmol/L）;④机制研究组:分别给予ICI182,780、氟他胺1μmol/L培养30min后,给予睾酮（30nmol/L）,30min后再给予H2O2（60μmoFL）。或先给予抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）1μmol/L培养30min后,再给予H2O2（60μmol/L）。3、MTT法检测细胞增殖能力。细胞染色法检测各组细胞的衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβgalactosidase,SA-B-gal）表达情况。2,7-二氯荧光黄（2,7-dichlorofluorescein,DCF）荧光显色检测细胞内活性氧水平。Western Blot法检测去磷酸化Rb蛋白的表达量。结果:1、不同浓度睾酮及生理浓度睾酮合用性激素受体拮抗剂对H2O2诱导的HUVECs增殖率的影响:与正常对照组比较,H2O2对照组的HUVECs增殖率下降,差异具有显著性（P=0.000）。LSD组间多重比较结果提示,与H2O2对照组比较,30nmol/L（生理浓度）睾酮干预组与300nmol/L、3nmol/L（稍高于或低于生理浓度）睾酮干预组的HUVECs的增殖率都具有升高的趋势（P=0.058,P=0.127,P=0.335）;3μmol/L（高于生理浓度）睾酮干预组却具有相反的作用（P=0.000）。与30nmol/L睾酮干预组比较,先给予雌激素受体拮抗剂ICI182,780孵育,可以降低HUVECs的增殖率,差异具有显著性（P=0.000）;而先给予雄激素受体拮抗剂氟他胺,却可以升高HUVECs的增殖率,差异也具有显著性（P=0.000）。2、不同浓度睾酮及生理浓度睾酮合用性激素受体拮抗剂对H2O2诱导的HUVECs的SA-B-gal阳性细胞百分率的影响:与正常对照组比较,H2O2对照组的HUVECs的SA-β-gal染色阳性细胞百分率升高,差异具有显著性（P=0.000）。LSD组间多重比较结果提示,与H2O2对照组比较,30nmol/L（生理浓度）睾酮干预组与300nmol/L、3nmol/L（稍高于或低于生理浓度）睾酮干预组的阳性细胞百分率都有降低的趋势,P分别为0.094、0.115、0.464。与30nmol/L睾酮干预组比较,先给予雌激素受体拮抗剂ICI182,780预处理,阳性细胞百分率升高,差异具有显著性（P=0.000）;而先给予雄激素受体拮抗剂氟他胺预处理,却可以降低阳性细胞百分率,差异也具有显著性（P=0.038）。3、抗氧化剂、生理浓度睾酮及其合用性激素受体拮抗剂对H2O2诱导的HUVECs内ROS水平的影响:与正常对照组比较,H2O2对照组的HUVECs的相对DCF荧光强度增加,差异具有显著性（P=0.000）。LSD组间多重比较结果提示,与H2O2对照组比较,抗氧化剂NAC干预组的HUVECs的相对DCF荧光强度减弱,差异具有显著性（P=0.000）;30nmol/L睾酮干预组的HUVECs的相对DCF荧光强度也呈减弱趋势,P=0.362。与30nmol/L睾酮干预组比较,予雌激素受体拮抗剂ICI182,780预处理,可以增强HUVECs的相对DCF荧光强度,差异具有显著性（P=0.002）;而先予雄激素受体拮抗剂氟他胺预处理,可以减弱HUVECs的相对DCF荧光强度,差异也具有显著性（P=0.004）。4、抗氧化剂、生理浓度睾酮及其合用性激素受体拮抗剂对H2O2诱导的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表达的影响:与正常对照组比较,H2O2对照组的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表达量增加,差异具有显著性（P=0.000）。LSD组间多重比较结果提示,与H2O2对照组比较,NAC干预组的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表达量减少,差异具有显著性（P=0.000）;30nmol/L睾酮干预组的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表达量减少,P=0.132。与30nmol/L睾酮干预组比较,予雌激素受体拮抗剂ICI182,780预处理,细胞的去磷酸化Rb蛋白表达量增多,差异具有显著性（P=0.000）;而予雄激素受体拮抗剂氟他胺预处理,细胞的去磷酸化Rb蛋白表达量表达量减少,差异也具有显著性（P=0.000）。结论:通过本研究,我们能够得出以下结论:1、60Mmol/L的H2O2持续作用72h后,HUVECs细胞内活性氧水平增加,去磷酸化Rb蛋白表达增加,细胞增殖能力减弱,SA-β-gal染色阳性细胞百分率增加,细胞发生了衰老。提示ROS引起的氧化应激是HUVECs衰老的重要机制之一。2、30nmol/L（生理浓度）睾酮与300nmol/L、3nmol/L（稍高于或低于生理浓度）睾酮都具有升高H2O2诱导的HUVECs的增殖率、降低SA-β-gal染色阳性细胞百分率的趋势。3μmol/L（高于生理浓度）睾酮却具有相反的作用。提示睾酮对HUVECs衰老的干预作用与其浓度相关。3、与30nmol/L睾酮干预组比较,先给予雌激素受体拮抗剂ICI182,780孵育,可以拮抗30nmol/L睾酮的干预作用,增加HUVECs细胞内ROS水平和去磷酸化Rb蛋白表达,降低H2O2诱导的HUVECs的增殖率,升高SA-β-gal染色阳性细胞百分率;而先给予雄激素受体拮抗剂,却具有相反的作用。提示生理浓度的睾酮或许能通过部分芳香化转化为雌激素后,作用于雌激素受体,减少细胞内的氧化应激和去磷酸化Rb蛋白表达,影响细胞周期,干预血管内皮细胞衰老。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 1.1 文献综述
• 1.2 英文缩略词表
• 1.3 攻读学位期间成果
• 致谢