论文摘要
第一部分乳腺癌标本及乳腺细胞系中Notch信号通路的表达、活化及γ分泌酶抑制剂对乳腺癌细胞增殖的影响研究背景:Notch信号传导通路是在进化过程中高度保守的信号传导系统,由Notch受体和配体组成。Notch基因编码4种跨膜蛋白分子,分别为Notch1,Notch2,Notch3,Notch 4,作为受体与相应配体（Delta-like 1,Delta-like 3,Delta-like 4,Jagged 1和Jagged 2）结合。位于细胞膜表面的Notch受体与相应配体结合后,引发分别由TACE（TNF-α-converting enzyme）和γ-secretase/presenilin complex介导的水解过程,释放其活性片段N-IC.N-IC转至细胞核内,与DNA结合蛋白CBF1/Su（H）/Lag1（CSF）结合后,激活其下游靶基因Hes、Hey等的转录。Notch信号通路主要介导细胞的分化抑制信号,在胚胎发育、T细胞发育、肿瘤形成等生理病理过程中发挥重要作用。近年来研究发现,Notch信号的异常表达与乳腺癌的发病相关。在对MMTV（mouse mammary tumor virus）导致的CzechⅡ小鼠乳腺肿瘤模型的研究中发现,Notch4及Notch1基因存在MMTV的插入位点。病毒的插入导致Notch蛋白跨膜区及胞内区的异常表达,提示Notch通路参与乳腺癌的发生。进一步研究证实,外源组成性活化表达的Notch1或Notch4可以使正常鼠和人乳腺上皮细胞发生恶性转化。在对人类乳腺癌标本的研究中发现,50%的乳腺癌标本存在Numb蛋白（Notch通路的负性调节因子）的缺失,在过表达H-ras的乳腺癌标本中发现Notch1蛋白的高表达,这种高表达与病人不良预后相关。研究目的:研究在人类乳腺癌标本中Notch通路表达与活化情况,用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch的活化,观测其对乳腺癌增殖的影响。研究方法:1.收集乳腺癌患者肿瘤组织标本,以癌旁正常乳腺组织作为对照。Trizol方法提取组织总RNA,在一定的反应体系中逆转录成cDNA,PCR方法检测Notch1,Notch3,Notch4,Jagged1和Delta-like 4在mRNA水平的表达情况2.体外培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231,MDA-MB-435。Trizol方法提取组织总RNA,在一定的反应体系中逆转录成cDNA,PCR方法检测Notch1,Notch3,Notch4,Jagged1和Delta-like 4在mRNA水平的表达情况,3.免疫化学染色:收集10例乳腺癌组织和4例癌旁正常乳腺组织石蜡切片,脱腊,抗原修复后用抗N1-IC抗体对标本进行免疫组化染色;或体外培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435,细胞爬片,固定后用N1-IC抗体对标本进行免疫染色,以检测Notch1在乳腺癌组织和细胞中的活化情况。4.γ分泌酶抑制剂对乳腺癌细胞增殖的影响:取指数生长期细胞消化计数后按4×103/孔接种于6孔板中,次日（待细胞70%-80%融合）加入3μmol/L的γ分泌酶抑制剂,阻断Notch的活化,以相同体积的DMSO做对照。作用24小时后MTT方法检测细胞增殖情况。5.流式细胞仪检测γ分泌酶抑制剂对乳腺癌细胞周期的影响:取指数生长期细胞消化计数后按2×105/孔接种于6孔板中,次日（待细胞70%-80%融合）加入3μmol/L的γ分泌酶抑制剂,阻断Notch的活化,以相同体积的DMSO做对照。作用24小时后收集细胞,PI染色后流式细胞仪检测细胞周期变化。6.流式细胞仪检测γ分泌酶抑制剂对细胞凋亡率的影响:取指数生长期细胞消化计数后按2×105/孔接种于6孔板中,次日（待细胞70%-80%融合）加入3μmol/L的γ分泌酶抑制剂,阻断Notch的活化,以相同体积的DMSO做对照。作用24小时后收集细胞,AnnexinV/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率变化研究结果:1.Notch受体及其配体在乳腺癌组织和细胞中呈高表达:共检测62例乳腺癌标本及其癌旁正常乳腺组织。Notch1,3,4,Jagged1和Delta-like 4在乳腺癌标本中的阳性表达率分别是98%,35%,8%,15%,81%,而在癌旁正常组织中的阳性表达率为73%,0%,0%,0%,0%。所检测Notch受体及其配体在乳腺癌中的mRNA表达阳性率显著高于癌旁组织;在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435中Notch-1,3和Jagged1均呈阳性表达。2.乳腺癌组织及细胞中存在Notch1通路的活化:利用特异性识别Notch1活化形式N-IC的抗体,通过免疫组化和免疫细胞染色方法,检测Notch1通路的活化情况。共检测10例乳腺癌标本和4例正常乳腺组织。在9/10例乳腺癌组织的细胞核中发现N-IC的聚集,提示Notch1的活化,而在正常乳腺组织均呈阴性染色;在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435均发现Notch1的活化。3.γ分泌酶抑制剂能够抑制乳腺癌细胞的增殖:γ分泌酶抑制剂作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435 24小时后显著抑制其增殖,并且呈剂量依赖性。4.γ分泌酶抑制剂能够使乳腺癌细胞周期阻滞于G2/M期。γ分泌酶抑制剂作用于乳腺癌细胞24小时后,与对照组比较,其G2/M期细胞分别为29.9%vs15.99%（MDA-MB-231）.and 45.5%vs 16.63%（MDA-MB-435）,有显著性差异。5.γ分泌酶抑制剂能够增加乳腺癌细胞凋亡率:γ分泌酶抑制剂作用于乳腺癌细胞24小时后,与对照组比较,其凋亡率分别是3.03%vs 0.94%（MDA-MB-231）.和4.33%vs 0.23%（MDA-MB-435）。提示γ分泌酶抑制剂能够诱导乳腺癌细胞的凋亡。结论:1.Notch通路分子在人类乳腺癌及乳腺癌细胞系中广泛表达和活化2.γ分泌酶抑制剂阻断其活化后可以抑制乳腺癌细胞的增殖,导致乳腺癌细胞周期阻滞和诱导其凋亡。因此,Notch信号通路可以作为抗乳腺癌治疗的潜在靶点。第二部分siRNA介导的Notch1下调对乳腺细胞增殖及药物敏感性的影响研究背景:RNA干扰（RHA interference）是一种由双链RNA诱发的基因沉默。在此过程中,与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解,从而抑制了该基因的表达。长于30个碱基对的双链RNA常常会激活蛋白激酶而诱发对蛋白质合成的非特异抑制,而小干扰性RNA（small interfering RNA,siRNA）是长度为21-23bp左右的RNA片段,一般不会在哺乳类细胞中诱发这种非特异性抑制。用人工合成的siRNA可特异性地抑制哺乳类细胞中外源性或内源性基因的表达。siRNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。在siRNA上一个错配的碱基对即可使其失去原有的抑制基因表达的活性。换言之,只有与siRNA高度同源的mRNA才会被降解。有研究证实,siRNA可以阻断90%以上的目的基因的表达。siRNA的高度特异性和高效性在将RNA干扰技术用于治疗人类疾病时极为重要,为减少或避免抑制不相关基因奠定了基础。我们在前面的研究中发现,Notch1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中广泛表达和活化,用γ分泌酶抑制剂阻断其活化后可以抑制乳腺癌细胞的增殖,导致其周期阻滞和凋亡。但γ分泌酶抑制剂是一种具有多种活性的化学合成药物,对γ分泌酶抑制剂的一期临床实验显示,患者可能对之产生不可耐受的胃肠道反应。除此之外,γ分泌酶抑制剂还可能具有脱靶效应。为了进一步阐明Notch信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响,我们探讨了其他阻断Notch信号通路的方法——即siRNA。我们用针对Notch 1的siRNA来阻断Notch1的表达,观测其对乳腺癌细胞增殖及对化疗药物敏感性的影响。并且探讨了Notch信号通路与另一影响细胞增殖与分化的重要信号系统-NF-kappaB的关系。研究目的:用siRNA阻断Notch1的表达后检测Notch信号对乳腺癌细胞增殖的影响,并阐明其分子机制,为乳腺癌的分子靶向治疗提供新的作用位点。研究方法:1.siRNA片段的转染:取指数生长期细胞消化计数后按1.2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,24小时后应用Lipofectamine2000将针对Notch1的siRNA片段转染乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7。72小时后real-time PCR方法检测siRNA片段对Notch1 mRNA表达的阻断效率。2.MTT方法检测siRNA片段对乳腺癌细胞增殖的影响:取指数生长期细胞消化计数后按4×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,24小时后转染siRNA片段。转染后72小时MTT方法检测小干扰片段对细胞的增殖的影响。3.流式细胞仪检测siRNA片段对细胞周期的影响:取指数生长期细胞消化计数后按1.2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,24小时后转染siRNA片段,转染后72小时收集细胞,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。4.流式细胞仪检测siRNA片段对细胞凋亡率的影响:取指数生长期细胞消化计数后按1.2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,24小时后转染siRNA片段,转染后72小时收集细胞,AnnexinV/PI双染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。5.MTT方法检测siRNA片段对乳腺癌细胞化疗药物敏感性的影响:取指数生长期细胞消化计数后按4×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,24小时后转染siRNA片段。转染后24小时加入1.5nM docetaxel或75μg/ml doxorubicin抚育48小时,MTT检测细胞增殖情况。6.Western-blot检测通路相关蛋白表达情况:取指数生长期细胞消化计数后以2×105接种于10cm培养皿,24小时后转染siRNA片段,转染后72小时收集细胞,提取细胞总蛋白,Western-blot检测通路相关蛋白的表达情况。7.EMSA检测NF-KappaB活性变化:取指数生长期细胞消化计数后按1.2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,24小时后转染siRNA片段,转染后72小时收集细胞,提取细胞核蛋白,EMSA检测NF-KappaB活性变化研究结果:1.针对Notch1的siRNA片段可以有效下调Notch1的表达:siRNA转染后72小时,干扰组Notch1和其下游基因Hes1 mRNA的表达较对照组下降90%,Notch1和Hes1蛋白表达同样显著下调。2.下调Notch1表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖:MDA-MB-231转染siRNA后72小时,MTT检测其吸光度值,干扰组为0.332±0.0563,对照组为0.559±0.044,P值为0.0053,有显著统计学意义;MCF7在转染后72小时MTT检测其吸光度值,干扰组为0.3060±0.073 1,对照组为0.6077±0.0049,P值为0.0020,有显著统计学意义。siRNA介导的Notch 1表达下调能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖。3.下调Notch 1的表达能够引起乳腺癌细胞的周期阻滞:MCF7转染siRNA后72小时,流式细胞仪检测细胞周期分布,干扰组为:G1:78.5%,G2:5.34%,S:19.54%:而对照组细胞的周期分布为:G1:54.29%,G2:8%,S:38.7%,与对照组细胞比较,下调Notch 1的表达能够导致MCF7的细胞周期阻滞于S期,而对MDA-MB-231细胞的周期无明显作用。4.下调Notch 1的表达能够增加乳腺癌细胞的凋亡率:MDA-MB-231细胞转染siRNA后72小时,AnnexinV/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡率,干扰组为5.64%,对照组凋亡率为1.25%:MCF7转染siRNA后72小时,干扰组凋亡率为2.88%,对照组为0.94%。下调Notch 1的表达能够显著增加乳腺癌细胞的凋亡率。5.下调Notch 1的表达能够增加乳腺癌细胞对docetaxel或doxorubicin的药物敏感性:MDA-MB-231和MCF7细胞转染后24小时,加入1.5nM docetaxel或75ng/ml doxorubicin作用48小时。结果显示docetaxel或doxorubicin对干扰组MDA-MB-231和MCF7细胞的增殖抑制效率较对照组分别增加50%或70%。对其机制的研究显示,Notch 1下调后可以增强docetaxel或doxorubicin对MDA-MB-231和MCF7细胞的凋亡诱导效率。6.下调Notch 1的表达能够降低NF-KappaB活性:MDA-MB-231和MCF7细胞转染后72小时,EMSA检测显示干扰组NF-KappaB活性较对照组明显降低。结论:1.我们所用siRNA可以有效阻断Notch1的表达2.siRNA介导的Notch1表达下调能够引起细胞周期阻滞和细胞凋亡率增加,从而抑制乳腺癌细胞的增殖,3.siRNA介导的Notch1表达下调能够增加乳腺癌细胞对docetaxel或doxorubicin的药物敏感性。4.siRNA介导的Notch1表达下调可以抑制NK-kappaB的DNA结合活性。因此,Notch1是治疗乳腺癌的有效分子靶点,并且可以和传统的化疗药物联合应用,以降低化疗药物毒副作用,增强其抗肿瘤治疗效果。