利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究

论文摘要

冰晶核蛋白（Ice nucleation protein,简称为INP）是一种分泌型表面蛋白质,存在于丁香假单胞菌、欧文氏菌等十余种革兰氏阴性菌中。近十年来,冰晶核蛋白作为细菌细胞表面展示系统的运载蛋白受到了广泛重视,被用来展示不同种类的外源蛋白,逐渐被探索应用于各种生物技术领域。本研究通过克隆实验室自行分离的一株丁香假单胞菌高冰核活性菌株MB03的冰核基因（inaQ）,对其表达特性、表达产物的跨膜分泌活性、作为运载蛋白的表面展示性能及重组菌株在无机磷吸附和抑制软腐病原菌侵染的应用性能进行了研究,结果如下：1.冰核基因的克隆用EcoR I/Pst I酶切MB03菌株总DNA,回收4-5 kb的酶切片段构建基因文库。根据已发表inp基因的保守序列设计简并性杂交探针,通过原位杂交法从大肠杆菌文库中筛选并克隆到包含启动子序列和完整编码框的冰核基因,命名为inaQ （GenBank:EU360731）。序列比对分析表明,inaQ基因与另外3种报道的丁香假单胞菌冰核基因inaK、inaV和inaZ的序列相似性分别为89.2%、93.9%和93.4%,编码1200个氨基酸的蛋白质（InaQ）。序列结构预测表明InaQ具有冰晶核蛋白典型的三个结构域,N末端域（InaQ-N,175 aa）,C末端域（InaQ-C,49 aa）和中间重复单元结构域（976aa）。其中InaQ-N中有2个跨膜信号分子序列,而InaQ-C含有较多的亲水性氨基酸。2.InaQ表达活性和跨膜分泌活性分析通过检测大肠杆菌和恶臭假单胞菌重组菌冰核活性,证实全长inaQ在外加启动子的启动下能在宿主菌中表达并赋予宿主菌较高的冰核活性。以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因构建inaQ/gfp融合基因,经NcoI/EcoRI双酶切后连接至大肠杆菌表达载体pTrcHis-C,携带该融合基因的大肠杆菌重组菌经IPTG诱导表达,对表达产物进行蛋白酶、SDS和EDTA敏感性分析以及流式细胞仪分析,结果表明InaQ/GFP融合蛋白经跨膜分泌后在宿主菌表面展示效率达到60%以上信号肽预测分析显示InaQ的N末端无明显信号肽序列,但前18位氨基酸与蛋白的分泌性质相关。利用PCR的方法构建缺失N末端前18个aa编码序列的inaQ-N’融合基因inaQ-N’/gfp,导入大肠杆菌受体菌后,经荧光显微镜镜检和流式细胞仪检测重组菌的细胞表面GFP荧光强度,结果证明InaQ-N’/GFP融合蛋白只能在细胞内表达,但无法定位于细胞表面；而对表达InaQ的C末端与GFP蛋白融合的大肠杆菌重组菌细胞表面的荧光强度测定结果表明,InaQ的C末端无法锚定于细胞表面,从而证明InaQ蛋白的跨膜转运只与N末端结构域相关。3.利用InaQ构建大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面展示系统与性能分析将inaQ-N/gfp融合基因分别插入大肠杆菌JM109表达载体pTrcHis-C和大肠杆菌-假单胞菌穿梭表达载体pYMBP的Ncol/EcoRI酶切位点,并转化大肠杆菌JMl 09和恶臭假单胞菌AB92019受体菌,得到相应重组菌株。通过免疫荧光显微镜镜检,细胞分级分离,Western Blot分析,蛋白酶、SDS和EDTA敏感性分析以及流式细胞仪分析等实验结果表明InaQ-N/GFP融合蛋白能定位于大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞外膜上,且表面展示效率均可达到40%以上进一步分别构建了2个和3个串联重复inaQ-N和gfp的融合基因,并分别导入大肠杆菌JM109和恶臭假单胞菌中表达。经细胞分级分离、Western Blot分析、流式细胞仪分析以及荧光显微镜镜检,结果显示以多拷贝串联重复InaQ-N结构域作为锚定单元展示GFP蛋白时,表面展示效率均提高到60%以上。因此,多个InaQ-N结构域具有协同作用,且提高了融合蛋白在两宿主菌表面的表达效率并增强了与外膜固着性能。4.大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白与工程菌吸磷能力分析从大肠杆菌K-12中PCR扩增得到磷酸盐吸附蛋白（PBP）的编码基因phoS,并构建inaQ-N/phoS融合基因,然后经连接至相应表达载体后,分别导入大肠杆菌和恶臭假单胞菌受体菌中表达。经Western Blot、流式细胞仪分析以及荧光显微镜镜检,结果证明融合蛋白InaQ-N/PBP分别成功展示在大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面。通过磷酸盐吸附能力实验表明5小时内,构建的工程菌的磷酸盐吸附量分别达到80 mg/L和60 mg/L,约是两宿主菌的100倍和3倍。同时3拷贝InaQ-N融合PBP在恶臭假单胞菌表面表达时,磷酸盐吸附量高达110 mg/L,是宿主菌6倍。此外,经42℃烘干致死的大肠杆菌和恶臭假单胞菌工程菌仍具有一定的磷酸盐吸附能力。5.在恶臭假单胞菌细胞表面展示AiiA蛋白与重组菌抑制软腐病性能的初步分析从苏云金芽胞杆菌BM171中由PCR扩增得到AHL内酯酶（AiiA）的编码基因aiiA,经BglⅡ/EcoRI双酶切后替换恶臭假单胞菌表面展示体系中的gfp基因,筛选得到表达inaQ-N/aiiA融合基因的重组菌。该菌株对作用于马铃薯片上并形成软腐病病斑的胡萝卜软腐欧文氏菌表现出一定程度的抑制效果,而细胞分级分离成分测定结果显示,该重组菌细胞质和细胞外膜组分均表现出抑菌活性。尽管冰晶核蛋白作为细胞表面展示的载体蛋白已应用于多个领域,但对其跨膜分泌锚定功能相关结构域以及分泌锚定机制尚缺乏研究。本研究对克隆得到的inaQ基因及表达蛋白质InaQ的分析表明,InaQ的N末端与蛋白质的分泌锚定性能相关,这为进一步研究InaQ的分泌锚定机制提供了依据。以N末端即可作为锚定单元行使分泌锚定功能,高效展示外源蛋白于大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面,缩短了锚定单元的大小,并为展示分子量更大的外源蛋白提供了可能。磷酸盐吸附蛋白的成功展示可为目前应用研究最为广泛的强化生物除磷法在有氧、高碳和低COD条件下除磷效果低的不足,提供一种补偿性的新技术途径,而AHL内酯酶的成功展示则对细胞表面展示体系在生物防治植物软腐病领域进行了探索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 细菌细胞表面展示技术进展
• 1.1.1 细菌细胞表面展示技术概述
• 1.1.2 细菌细胞表面展示体系的结构组成
• 1.1.3 存在的问题及展望
• 1.2 冰晶核蛋白研究进展
• 1.2.1 植物霜冻害
• 1.2.2 冰晶核蛋白概述
• 1.2.3 冰晶核蛋白的结构和功能
• 1.2.4 冰晶核蛋白的应用
• 1.2.5 冰晶核蛋白的细胞表面展示
• 1.3 无机磷酸盐吸附研究进展
• 1.3.1 化学除磷法
• 1.3.2 吸附法除磷
• 1.3.3 人工湿地系统
• 1.3.4 生物除磷法
• 1.3.5 大肠杆菌磷酸盐吸附蛋白
• 1.4 细菌AiiA研究进展概述
• 1.4.1 细菌的群体感应系统简介
• 1.4.2 软腐病致病原理简介
• 1.4.3 AHL内酯酶（AiiA）简介
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基配方及培养条件
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 试剂和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA操作
• 2.2.2 重组质粒的转化和转化子的筛选鉴定
• 2.2.3 菌落原位杂交
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 细菌细胞表面定位实验方法
• 2.2.6 冰核活性测定实验
• 2.2.7 磷酸盐吸附实验
• 2.2.8 抑制软腐病能力实验
• 3 结果与分析
• 3.1 冰晶核蛋白基因的克隆、蛋白质结构预测分析与异源表达的跨膜分泌活性
• 3.1.1 丁香假单胞菌冰晶核蛋白基因的克隆
• 3.1.2 冰晶核蛋白编码基因的序列分析
• 3.1.3 冰晶核蛋白氨基酸序列分析
• 3.1.4 冰晶核蛋白基因在大肠杆菌中的表达和重组菌跨膜分泌活性检测
• 3.2 利用冰晶核蛋白构建大肠杆菌细胞表面展示系统与性能分析
• 3.2.1 大肠杆菌展示载体的构建
• 3.2.2 大肠杆菌展示体系的优化
• 3.2.3 细胞表面定位分析
• 3.2.4 多拷贝串联重复InaQ-N展示载体的构建
• 3.2.5 多拷贝串联重复InaQ-N展示体系的细胞表面定位分析
• 3.3 利用冰晶核蛋白构建恶臭假单胞菌表面展示系统与性能分析
• 3.3.1 恶臭假单胞菌细胞表面展示载体的构建
• 3.3.2 恶臭假单胞菌展示体系的优化
• 3.3.3 细胞表面定位分析
• 3.3.4 多拷贝串联重复InaQ-N展示载体的构建
• 3.3.5 多拷贝串联重复InaQ-N展示体系的细胞表面定位分析
• 3.4 在大肠杆菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白与工程菌生物吸磷性能
• 3.4.1 表面展示载体的构建
• 3.4.2 细胞表面定位分析
• 3.4.3 磷酸盐标准曲线的测定
• 3.4.4 磷酸盐溶液初始浓度及检测时间的确定
• 3.4.5 磷酸盐吸附能力的测定
• 3.5 在恶臭假单胞菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白与工程菌生物吸磷性能
• 3.5.1 表面展示载体的构建
• 3.5.2 细胞表面定位分析
• 3.5.3 磷酸盐吸附能力的测定
• 3.6 在恶臭假单胞菌细胞表面展示AiiA蛋白与工程菌抑制胡萝卜软腐病性能
• 3.6.1 表面展示载体的构建
• 3.6.2 融合蛋白的表达
• 3.6.3 抑制软腐病分析
• 4 讨论
• 4.1 冰晶核蛋白InaQ的分析
• 4.2 冰晶核蛋白InaQ与分泌锚定相关结构域的确定
• 4.3 InaQ-N展示性能分析
• 4.4 磷酸盐吸附能力检测
• 4.5 抑制软腐病性能分析
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 发表论文情况
• 附录2 冰核基因inaQ及其编码氨基酸序列