重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞生长、侵袭和转移的影响

论文摘要

研究背景及目的肝癌（Hepatacellular carcinoma,HCC）,是我国常见恶性肿瘤之一,死亡率高,在恶性肿瘤死亡排序中居第三位,在部分地区的农村则占第二位。我国每年死于肝癌约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。近年来,由于肝癌早期诊断和治疗手段的进步,使得肝癌的5年生存率有所提高。但目前各种肝癌治疗手段的效果仍不够满意。其中门静脉癌栓的形成、肝内及远处的侵袭转移是肝癌治疗效果差、病情进展快的重要原因。因此,进一步对肝癌进行研究,并寻求肝癌新的治疗方法和药物显得非常有必要。血管内皮抑素（Endostatin）是细胞外基质胶原ⅩⅧ羧基末端片断,最初是从鼠成血管细胞瘤株培养液中分离提纯得到的一种内源性糖蛋白,能够特异性地作用于新生血管的内皮细胞,直接抑制内皮细胞的增殖、转移并诱导其凋亡而发挥抗血管生成作用。Endostatin通过抑制血管内皮细胞达到抗肿瘤作用的机制已被广泛证实。近来Endostatin直接抑制某些肿瘤细胞生长和侵袭转移的研究也有了初步的报道,但国内外尚未见Endostatin对肝癌细胞有直接作用的研究报道。美国Entremed公司采用酵母作为表达体系生产的Endostatin先后进行了Ⅰ期和Ⅱ期的临床实验,但由于其体外不稳定性和生产成本高等原因,在临床上未得到继续应用。我国江苏先声药业生产自行研制的新型Endostatin制剂—重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin,endostarTM,恩度TM),解决了国外Endostatin制剂的多个难题。在多项动物实验中均显示其能有效抑制内皮细胞增殖、血管生成和肿瘤生长,在临床应用于肺癌的治疗中也取得令人鼓舞的疗效。本课题拟将rh-Endostatin为主要实验试剂,研究其体外对人肝癌细胞株HepG2和高侵袭潜能人肝癌细胞株HCCLM6的增殖、细胞周期、细胞凋亡以及细胞侵袭转移能力的影响,并试图探讨其作用机制。以完善rh-Endostatin抗肿瘤机制,了解rh-Endostatin在肝癌治疗中的应用可能,为其临床应用提供进一步的理论依据。第一章重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞增殖、周期与凋亡的影响一、材料与方法1.将贴壁培养的HCCLM6及HepG2细胞消化收集计数后,分别加入整合素α5β1抗体和FITC—羊抗小鼠IgG二抗,同时设阴性对照组;采用免疫荧光法,用流式细胞仪定量检测两细胞株表面整合素α5β1的表达率。2.分别将HCCLM6及HepG2细胞接种于共聚焦测试平皿中,待细胞完全贴壁后,4%多聚甲醛固定,加入整合素α5β1抗体和FITC—羊抗小鼠IgG二抗,并加入Hochest33258染液进行细胞核负染;于激光共聚焦荧光显微镜下拍照观察,检测rh-Endostatin作用受体整合素α5β1在两种细胞的定性定位表达。3.分别将rh-Endostatin或BSA包被96孔酶标板中,实验设单纯包被BSA组、单纯包被rh-Endostatin组和包被rh-Endostatin+Anti-α5β1干扰组,分别将无血清DMEM悬浮的HCCLM6及HepG2细胞接种到每孔,继续培养4h,去除未粘着的细胞后,MTT法、酶标仪检测粘着细胞的OD值,进行分析比较,检测两种细胞是否通过整合素α5β1介导与rh-Endostatin间结合及其程度。4.分别以终浓度为0、50、100、200和400μg/ml rh-Endostatin处理HCCLM6及HepG2细胞,MTT法检测处理24、48及72h后吸光值OD值,检测并分析rh-Endostatin对两细胞增殖的影响及差别。5.实验分组同前。流式细胞仪分别检测rh-Endostatin处理HCCLM6及HepG2细胞24h后对周期的分布,并分析其差别。6.细胞分组同前。培养72h后收集细胞,采用凋亡荧光双染试剂AnnexinV-FITC及PI染液、流式细胞仪分别检测rh-Endostatin处理HCCLM6及HepG2细胞72h后对细胞凋亡的影响,并分析其差别。二、统计方法实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计处理,定量资料数据以（?）±s表示,多组比较采用One-Way ANOVA分析（方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Tamhane法）;经过不同药物浓度、处理不同时间的细胞增殖资料采用析因分析;P≤0.05为统计学意义。三、结果1.流式细胞仪检测整合素α5β1在HCCLM6细胞上表达率为85.3%,在HepG2细胞表达率仅为18.8%。2.激光共聚焦荧光显微镜下进行观察到整合素α5β1主要表达在两种细胞的细胞膜表面上。3.HCCLM6与HepG2细胞均能明显的与包被固化的rh-Endostatin结合,与包被BSA组比较,差异显著（P均为0.000）。经Anti-α5β1预孵育后的HCCLM6细胞与rh-Endostatin的结合明显较未经处理组的细胞明显减少（P=0.000）。而Anti-α5β1预孵育后的HepG2与未经处理组间无明显差别（P=0.077）。说明Anti-α5β1可明显阻断整合素α5β1高表达的HCCLM6细胞与rh-Endostatin的结合,而对整合素α5β1表达低的HepG2细胞无明显阻断作用。这也说明整合素α5β1可能为rh-Endostatin作用于肝癌细胞上的功能受体。4.Rh-Endostatin对两细胞株的增殖抑制均有较明显的剂量效应及时间效应关系。Rh-Endostatin作用24、48h后,对HCCLM6细胞增殖影响较小,作用72h后抑制作用明显增强,最高抑制率达42.3%。而rh-Endostatin各剂量组、各时间段对HepG2细胞增殖抑制率均较小,只有在高浓度、作用时间72h后,才有一定的抑制作用。5.随rh-Endostatin浓度升高（50～400μg/ml）,HCCLM6处于G1期的细胞比例增加,S期细胞比例减少,G2期细胞也稍有增加,其中200、400μg/ml组G1期细胞比例与对照组比较差异显著（P均为0.000）,100μg/ml组与对照组比较差异有统计学意义（P=0.031）;400μg/ml组S期细胞比例与对照组比较差异显著（P=0.004）。而rh-Endostatin对HepG2细胞周期分布影响不明显,只有在400μg/ml高浓度时,G1期细胞比例稍增加,与对照组比较差异有统计学意义（P=0.043）。6.Rh-Endostatin处理后的HCCLM6细胞经流式细胞仪检测结果显示,rh-Endostatin能够明显诱导HCCLM6细胞凋亡,并随给药剂量的增加,凋亡率增高。Rh-Endostatin剂量在50～400μg/ml时,凋亡率处于12.5±0.8%～31.0±1.4%间,与对照组比较差异显著（P均小于0.01）。Rh-Endostatin对HepG2细胞凋亡的诱导作用较小,只有浓度为200、400μg/ml的凋亡率分别为11.2±0.9%、11.6±1.1%,与对照组比较有统计学意义（分别P=0.025）。第二章重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞粘附、侵袭及转移的影响一、材料与方法1.HCCLM6及HepG2细胞分别与终浓度为0、50、100、200及400μg/ml的rh-Endostatin混和,接种于包被有基质胶matrigel的96孔板中,2h后去除未粘附细胞,用MTT法检测粘附细胞数量并计算粘附抑制率。以检测rh-Endostatin对细胞粘附能力的影响。2.实验分组同前。分别将HCCLM6及HepG2细胞接种于涂有matrigel胶的transwell上室内,下室加入含15%FBS的DMEM培养液作为趋化因子,继续培养24h后,棉签抹去滤膜上层细胞后,甲醇固定滤膜,用Giemsa染料染色。100倍光镜下计算膜上下左右中5个不同视野穿过膜的细胞数,求平均值,计算rh-Endostatin对肝癌细胞的侵袭抑制率。3.体外迁移实验与体外侵袭力的检测相同,通过将细胞接种于未铺matrigel人工基底膜胶的transwell小室内,加入药物干扰,置培养箱中12h后取出。检测rh-Endostatin对肝癌细胞迁移能力的影响。4.明胶酶谱测定金属蛋白酶（MMPs）活性:加入不同浓度rh-Endostatin处理的HCCLM6和HepG2细胞培养基经含1mg/ml明胶的10%SDS-PAGE电泳,在经过2.5%Triton X-100洗脱液和漂洗液洗涤去除SDS,恢复MMPs活性,于孵育液（50mmol/l Tris-HCl,5mmol/l CaCl2,1μmol/l ZnCl2,0.02%Brij-35,pH7.6）中37℃孵育42h,0.5%考玛斯亮蓝R-250染色3h后脱色,采用凝胶成像仪扫描条带;BandScan图像分析系统读取条带灰度值及所占总蛋白灰度的百分比。计算MMPs活性率,以反映rh-Endostatin对两种细胞MMP的影响。二、统计方法实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计处理,定量资料数据以（?）±s表示,多组比较采用One-Way ANOVA分析（方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Tamhane法）;P≤0.05为统计学意义。三、结果1.Rh-Endostatin能够明显抑制HCCLM6细胞对matrigel的粘附能力,各实验组与对照组比较,均有显著性差异（P值均为0.000）,其抑制率为26.4～49.4%。而rh-Endostatin对HepG2细胞的粘附抑制作用明显较对HCCLM6细胞作用弱,只有在较高剂量200μg/ml、400μg/ml组时才具有较小的抑制作用,抑制率分别为13.3%和17.5%。Rh-Endostatin对两细胞株粘附抑制作用均存在一定的剂量依赖性,随浓度的增加而升高。2.经rh-Endostatin处理的HCCLM6细胞穿过人工基底膜matrigel胶细胞数较对照组明显减少,与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,50～400μg/ml的侵袭抑制率为17.1%～56%。而rh-Endostatin对HepG2细胞穿过matrigel胶抑制作用不明显,抑制率为4.1～15.1%,其中200μg/ml、400μg/ml处理组穿过matrigel胶细胞数与对照组比较差异有统计学意义（P值分别为0.004,0.035）。同样,rh-Endostatin对两细胞株的侵袭抑制作用也存在剂量依赖性,随剂量增加,抑制作用增强。3.Rh-Endostatin能够剂量依赖性的抑制HCCLM6及HepG2细胞穿过聚碳酸酯膜的能力,对HCCLM6细胞的迁移抑制率为7.8%～41.1%,而对HepG2细胞抑制作用明显较前者弱,在浓度为400μg/ml时抑制率仅为9%。对于HCCLM6细胞,200、400μg/ml组与对照组比较,差异显著（P均为0.000）,100μg/ml组与对照组比较差异有统计学意义（P=0.031）;对于HepG2细胞,只有浓度为400μg/ml与对照组比较差异有统计学意义（P=0.013）。4.培养基中MMP-2活性:Rh-Endostatin处理后的HCCLM6及HepG2细胞培养基在PAGE胶上可显示2条带,分别为pro-MMP-2和aMMP-2,HCCLM6培养基各组泳道中还隐约可见pro-MMP-9条带。两细胞培养基各组间MMP-2（pro-MMP-2+aMMP-2）占各泳道灰度总值百分比无统计学差异;随rh-Endostatin浓度的增加,aMMP-2带灰度和宽度减小,其中两细胞培养基中200、400μg/ml组未见aMMP-2条带,且50、100μg/ml组aMMP-2活性比（aMMP-2/MMP-2）与对照组比较,差异均显著。说明rh-Endostatin对HCCLM6及HepG2细胞MMP-2的生成无影响,但能明显抑制MMP-2的激活。结论整合素α5β1在高侵袭潜能人肝癌细胞株HCCLM6上高表达,HepG2肝癌细胞上表达较低;Rh-Endostatin对整合素α5β1高表达的HCCLM6细胞能剂量依赖性抑制其增殖,形成G1期阻滞,并可诱导其凋亡;Rh-Endostatin可显著的抑制整合素α5β1高表达的HCCLM6细胞体外的粘附、侵袭和迁移能力。而在这些方面,Rh-Endostatin对整合素α5β1低表达的HepG2细胞的作用不明显;同时rh-Endostatin还可通过抑制肝癌细胞所分泌MMP-2的激活,达到抗肿瘤侵袭转移作用。本实验证明了rh-Endostatin除可抗血管生成外,在体外还可直接作用于肝癌细胞,通过抑制其生长、侵袭和转移而达到抗肿瘤作用。这也进一步完善了rh-Endostatin的抗肿瘤机制,并为将来rh-Endostatin临床应用于肝癌的治疗提供了进一步的理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞增殖、周期与凋亡的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二章 重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞粘附、侵袭及转移的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 英文缩略词表
• 成果
• 致谢
• 统计学证明