衣霉素诱导内质网应激介导的胃癌BGC823细胞凋亡

论文摘要

内质网是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所,也是调节和贮存细胞钙水平的重要场所。内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）是由于未折叠或错误折叠的蛋白质累积或内环境的Ca2+浓度的改变导致了内质网结构和功能的失衡引起的。在这种情况下,内质网的反应以特定蛋白质的改变为特征:翻译速率的下调;内质网伴侣蛋白的表达上调;错误折叠蛋白质的降解。一般情况下,这一系列反应能成功恢复内质网的内环境平衡。但是,在多细胞动物里,持久或者强烈内质网应激会导致细胞凋亡。缺氧和未正确折叠蛋白在腔内聚集以及胞浆Ca2+失衡均可以导致其紊乱,从而诱发一系列相关蛋白质表达和细胞表型改变,称为内质网应激（ERS）。内质网应激对决定应激细胞的结局如抵抗、适应、损伤或凋亡有重要作用。蛋白质在内质网腔形成空间结构由许多分子伴侣蛋白协助,其中最主要的是葡萄糖调节蛋白质GRP家族的GRP78/BIP,对细胞起保护作用,恢复蛋白质正确构像;同时,转录因子ATF6及跨膜蛋白激酶PEKR的活化可诱发一系列内质网应激靶基因的转录表达。其中GADD153/CHOP基因的编码蛋白可降低Bcl-2表达、使细胞谷胱甘肽耗竭引起细胞凋亡。内质网应激反应时间过长或强烈,还将活化定位于内质网的半胱天冬酶-12,继而引起半胱天冬酶级联反应,导致细胞凋亡。CHOP是作为一个C/EBPs（CCAAT/enhancer binding proteins）被发现的,也叫生长停滞和DNA损伤诱导基因153即GADD153（growth arrest and DNAdamage-153）,分子量约为27kDa,在人类有169个氨基酸残基,在啮齿类动物有168个氨基酸残基,GADD基因是有遗传毒性应激和生长停滞信号诱导的一组基因。有三个不同的GADD基因,但是他们之间又没有相似性。C/EBPs组成一个转录蛋白家族,与其他蛋白质因子一起组成复杂精细的调控网络,在细胞增殖、分化、信号传导、肿瘤发生以及机体的免疫、应激反应、能量代谢、血液生成等方面发挥重要作用。正常情况下,凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白CHOP（C/EBP-homologous protein）即C/EBP同源蛋白表达量十分低。但是在内质网应激的情况下,表达量则显著增加。所以CHOP是内质网应激的一个金标准。国内外研究证明了TM在神经系统、胰腺细胞等中内质网应激介导的细胞凋亡。但尚未见到在内质网应激介导的胃癌细胞凋亡的相关报道。我们用10μg/ml的TM分别以不同的时间胃癌BGC823细胞,从基因水平和蛋白表达水平检测TM诱导胃癌BGC823细胞内质网应激介导的细胞凋亡,从而证明TM能否诱导胃癌BGC823细胞内质网应激介导的细胞凋亡。方法:（1）体外培养胃癌BGC823细胞,在生长对数期用10μg/ml的TM分别处理0h、24h、36h、48h诱导胃癌BGC823细胞内质网应激。（2）活体培养观察细胞生长状态的变化、Annexin V-PI染色法检测凋亡观察胃癌BGC823表面形态的变化了解TM的诱导细胞凋亡的作用。（3）分别于0h、24h、36h和48h终止作用,RT-PCR技术检测TM作用前后CHOP-mRNA表达的变化。（4）应用Western blot技术检测CHOP蛋白在TM诱导前后表达水平的变化,从蛋白水平反映CHOP与诱导胃癌BGC823细胞内质网应激介导的细胞凋亡的关系。（5）所得结果运用SPSS统计软件包处理,统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示。以α=0.05为显著性检验标准。结果:（1）TM作用后,胃癌BGC823细胞生长状态呈细胞密度和聚集程度均下降,几个细胞散在生长多见,细胞体积缩小变圆且胞间距增大,细胞大小相差悬殊不大,胞质颗粒感增强,胞膜出芽脱落成大小不等的凋亡小体等改变。（2）Annexin V-PI染色法检测细胞凋亡结果显示,TM作用后,荧光显微镜下示绿色荧光细胞为凋亡细胞,红色荧光细胞为死亡细胞。随着处理时间的增加,凋亡细胞也增多。（3）TM诱导胃癌BGC823细胞内质网应激介导凋亡得过程中出现了CHOP的表达,且CHOP-mRNA表达水平存在时间依赖性。在一定得条件下,随着处理时间增长,表达量也增加。（4）Western-blot结果显示TM诱导胃癌BGC823细胞内质网应激介导凋亡得过程中出现了CHOP的表达,且CHOP蛋白水平表达存在时间依赖性。在一定得条件下,随着处理时间增长,表达量也增加。结论:TM可诱导内质网应激介导的胃癌BGC823细胞的凋亡

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分
• 衣霉素诱导内质网应激介导的胃癌BGC823细胞凋亡
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述部分
• CHO（?）/GADD153内质网应激中的作用
• 参考文献
• 中英文缩略
• 致谢