四倍体小麦低分子量麦谷蛋白基因家族的研究

论文摘要

低分子量麦谷蛋白是小麦谷蛋白的主要组成部分（约占60%）,在很大程度上决定着小麦的加工品质。编码LMW-GS的基因位于小麦第一同源群1A、1B和1D染色体短臂上,分别称为Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3（统称Glu-3）。低分子量麦谷蛋白亚基受多基因控制,并且在染色体上与醇溶蛋白基因紧密连锁,在SDS-PAGE上又不易与醇溶蛋白区分,所以低分子量麦谷蛋白的研究存在着很大难度。本研究以四倍体小麦Langdon BAC文库为材料,从中筛选鉴定小麦低分子量谷蛋白基因,为深入认识低分子量谷蛋白基因家族的成员组成、分布与进化等特点奠定基础。本研究的主要结果如下:1.利用保守引物对Langdon BAC文库初筛获得的BAC克隆进行PCR二次筛选,鉴定出25个阳性克隆,PCR克隆测序获得26条基因序列,根据推断的氨基酸序列分类原则,它们分属LMW-i、s和m三种类型,其中i型的有9个,s型的有11个,m型的有6个。通过聚类分析,26个基因被分为5类。2.根据不同类型基因序列之间的SNP设计了5对特异引物,特异引物能将不同类型的低分子量麦谷蛋白基因区分开来,并且这些引物在四倍体小麦Langdon及其代换系和六倍体小麦中国春及其缺体-四体中都表现出特异性,26个基因被定位到1A或1B染色体上。3.代表性BAC克隆459F23的测序与分析表明,该BAC克隆全长大约为175kb,含有CACTA、gypsy、copia和LINE等重复序列,一个不表达的低分子量麦谷蛋白基因、抗白粉病基因片段、RFLP标记SFR159,以及一些其它的基因片段。BAC克隆817O07,全长大约为103kb,序列分析表明,该BAC克隆含有CACTA、MITE和gypsy等重复序列,一个M型的低分子量麦谷蛋白基因、HBP-1a转录因子和RFLP标记SFR159。与四倍体小麦Langdon中其他一些BAC序列的微共线性分析表明,低分子量麦谷蛋白基因与RFLP标记SFR159具有很好的共线性。同时,根据SFR159序列的相似性和SFR159与LMW-GS基因之间序列的相似性分析可以推测,BAC817O07和BAC459F23在染色体上相距很近。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 小麦品质与小麦蛋白质的关系
• 1.2 低分子量麦谷蛋白的分类
• 1.3 低分子量麦谷蛋白的结构
• 1.4 低分子量麦谷蛋白基因在染色体上的定位
• 1.5 低分子量麦谷蛋白基因分子标记的开发
• 1.6 低分子量麦谷蛋白基因进化分析
• 1.7 立题依据及技术路线
• 1.7.1 立题依据
• 1.7.2 技术路线
• 2 小麦低分子量麦谷蛋白基因家族成员的克隆及分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 利用保守引物对筛选的阳性克隆进行扩增
• 2.2.1.1 BAC 克隆质粒DNA 的提取（碱裂解法）
• 2.2.1.2 扩增低分子量麦谷蛋白基因编码区域所用的引物
• 2.2.1.3 PCR 反应体系
• 2.2.1.4 PCR 反应程序
• 2.2.1.5 扩增片段的回收
• 2.2.1.6 目标片段的连接与转化
• 2.2.1.7 菌的培养
• 2.2.1.8 质粒的提取
• 2.2.1.9 扩增片段重组子的测序
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 携带低分子量麦谷蛋白基因BAC 克隆的鉴定
• 2.3.2 低分子量麦谷蛋白基因序列的获得
• 2.3.3 低分子量麦谷蛋白基因序列的比较与分析
• 2.4 讨论
• 3 不同类型低分子量麦谷蛋白基因特异标记的开发
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 植物基因组DNA 的提取
• 3.2.2 低分子量麦谷蛋白基因特异引物的设计
• 3.2.3 引物特异性的验证
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 低分子量麦谷蛋白基因特异引物的设计
• 3.3.2 引物特异性的验证
• 3.4 讨论
• 4 代表性BAC 克隆的测序与分析
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 BAC 亚克隆文库的构建
• 4.2.1.1 BAC DNA 的提取
• 4.2.1.2 BAC DNA 的切割
• 4.2.1.3 Mung Bean 绿豆核酸外切酶处理切割后的BAC DNA
• 4.2.1.4 外切酶酶切产物纯化
• 4.2.1.5 虾碱性磷酸酶脱磷处理
• 4.2.1.6 PCR 方法加尾
• 4.2.1.7 片段选择
• 4.2.1.8 DNA 的纯化
• 4.2.1.9 连接反应
• 4.2.1.10 连接产物的转化
• 4.2.1.11 亚克隆单克隆的制备及保存
• 4.2.2 BAC 亚克隆测序
• 4.2.2.1 亚克隆质粒DNA 的制备
• 4.2.2.2 亚克隆测序PCR 反应
• 4.2.3 BAC 全序列的拼接
• 4.2.4 BAC 全序列分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 BAC 全序列长度的确定
• 4.3.2 BAC 全序列的组装及初步分析
• 4.3.3 Glu-3 位点的进化分析
• 4.4 讨论
• 5 全文小结
• 参考文献
• 附录: 主要试剂配方
• ABSTRACT