海藻糖对神经干细胞玻璃化冻存过程影响的研究

论文摘要

为获得来源方便的神经干细胞，开展有效的干细胞移植及建立干细胞库，需长期低温保存神经干细胞。本文研究了神经干细胞在培养过程中海藻糖的影响和海藻糖的玻璃化能力，并进行神经干细胞的玻璃化冻存过程的研究。首先，对海藻糖在神经干细胞培养过程的影响进行了研究。在神经干细胞培养过程中分别加入0mol／L、0.3mol／L、0.15mol／L、0.075mol／L、0.05mol／L、0.025mol／L的海藻糖，通过CCK-8试剂盒连续六天进行测试，结果显示在神经干细胞培养过程加入海藻糖不会影响细胞的增值，同时保持了其干细胞的特征，并且可以诱导分化为神经元、少突胶质细胞、星型胶质细胞，从而确保了海藻糖应用于神经干细胞玻璃化冻存的安全性。其次，通过低温冷台和差示扫描量热实验，对海藻糖与蔗糖的玻璃化能力进行了比较，主要考察了玻璃化转变温度和反玻璃化的情况。在低温冷台上在100℃／min降温速率下，60％海藻糖和60％蔗糖均能实现玻璃化，但在以相同升温速率复温的过程中都有反玻璃化现象，60％蔗糖比60％海藻糖反玻璃化严重。在100℃／min降温速率下，海藻糖能够实现玻璃化的最低浓度是55％，而蔗糖能够实现玻璃化的最低浓度是58％。采用差示热量扫描技术测量样品的玻璃化转变温度，60％海藻糖、55％海藻糖、60％蔗糖和58％蔗糖溶液玻璃化转变温度分别为-29.7℃、-30.8℃、-39.4℃和-45.6℃。最后，将海藻糖与二甲基亚枫、乙二醇、乙酰胺组成联合冷冻保护剂用于神经干细胞的玻璃化冻存。通过在冷台上动态直观地观察，以及玻璃化冻存神经干细胞复苏率的比较，优选出了适合神经干细胞玻璃化冻存的冷冻保护剂组成为：20％（v／v）二甲基亚砜（DMSO）+20％（v／v）乙二醇（EG）+10％（w／v）乙酰胺（Acetamide）+0.5（M）海藻糖（Trehalose）。将优选出的冷冻保护剂分别用于两种神经干细胞的玻璃化冻存，一种是培养过程没有加入海藻糖，另外一种是培养过程加入0.5mol／L的海藻糖，实验结果显示神经干细胞在培养过程加入海藻糖对细胞玻璃化冻存后的复苏率有明显的提高，同时本文的实验结果与文献中报道过的20％（v／v）DMSO+20％（v／v）EG+10％（w／v）Acetamide+0.3（mol／L）Sucrose玻璃化冻存神经干细胞的复苏率也进行了比较，结果表明，在神经干细胞培养过程加入0.05mol／L的海藻糖，用本文优选出的保护剂玻璃化冻存后的复苏率为71.7％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 神经干细胞概述
• 1.1.1 干细胞的定义
• 1.1.2 神经干细胞的定义
• 1.1.3 神经干细胞存在位点和鉴定
• 1.1.4 神经干细胞的体外培养
• 1.2 低温保存技术概述
• 1.2.1 低温保存技术的发展历史
• 1.2.2 低温冷冻保护剂
• 1.2.3 低温冷冻保存的方法
• 1.2.4 低温损伤机理及假说
• 1.3 神经干细胞低温保存面临的问题
• 1.3.1 神经干细胞面临的问题
• 1.3.2 低温保存神经干细胞及其需要解决的问题
• 1.4 小结
• 2 神经干细胞的获得及体外培养
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验药品及试剂
• 2.1.3 实验药品及试剂
• 2.1.4 实验所需溶液和试剂的配制
• 2.1.5 原代取材
• 2.1.6 原代接种
• 2.1.7 神经干细胞传代操作及继代培养
• 2.1.8 神经干细胞的免疫细胞化学鉴定
• 2.1.9 诱导分化及免疫细胞化学
• 2.2 实验结果与讨论
• 2.2.1 小鼠神经干细胞原代和继代悬浮培养
• 2.2.2 细胞Nestin表达及BrdU检测结果
• 2.2.3 神经干细胞诱导分化及免疫荧光鉴定
• 2.3 小结
• 3 海藻糖对神经干细胞培养过程的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验装置
• 3.1.2 实验药品及试剂
• 3.1.3 实验所需试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 神经干细胞单细胞悬液的制备
• 3.2.2 24孔板培养神经干细胞
• 3.2.3 神经干细胞生长曲线的测定
• 3.2.4 细胞增值情况检测
• 3.2.5 神经干细胞的免疫细胞化学鉴定
• 3.2.6 神经干细胞诱导分化及免疫细胞化学
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 神经干细胞生长曲线与直径的关系
• 3.3.2 海藻糖对神经干细胞生长的影响
• 3.3.3 细胞Nestin表达及BrdU检测结果
• 3.3.4 神经干细胞诱导分化及免疫荧光鉴定
• 3.4 小结
• 4 海藻糖溶液玻璃化能力
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验装置
• 4.1.2 实验药品及试剂
• 4.1.3 实验所需试剂的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 低温冷台实验
• 4.2.2 差示扫描量热
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 蔗糖和海藻糖玻璃化转变浓度
• 4.4.2 样品玻璃化转变温度
• 4.5 小结
• 5 海藻糖对玻璃化冻存神经干细胞保护作用的初步研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验装置
• 5.1.2 实验药品
• 5.1.3 实验所需试剂的配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 神经干细胞单细胞悬液的制备
• 5.2.2 VS1-VS9玻璃化能力的低温冷台实验考察
• 5.2.3 四种玻璃化低温保护剂冻存NSCs
• 5.2.4 VS4、VS10玻璃化冻存培养过程加入海藻糖的神经干细胞
• 5.2.5 差示扫描量热
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 低温冷台观察
• 5.3.2 最佳玻璃化保护剂的确定
• 5.3.3 培养过程加入海藻糖对玻璃化冻存神经干细胞复苏率的影响
• 5.3.4 VS4、VS10玻璃化冻存NSCs复苏后活率比较
• 5.3.5 VS4、VS10玻璃化转变温度
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 英文缩略语
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢