FcεR Ⅰα亚基细胞外部分的重组表达单克隆抗体的制备及特异性鉴定

论文摘要

过敏性疾病是一种常见疾病,其临床表现有很多种,包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等。过敏性疾病是由Ⅰ型超敏反应引起的,其主要中间物质为IgE及其高亲和力受体（FcεRⅠ）。过敏原第一次侵入机体,可以诱导B淋巴细胞产生抗原特异性IgE,IgE与靶细胞表面的高亲和力受体结合以后,当相同抗原再次侵入机体时,就可以引发靶细胞内的一系列信号转导,使靶细胞释放组胺等生物活性物质,引起过敏性炎症反应。因此,IgE高亲和力受体是引起过敏性疾病的关键物质,也是本研究的重点对象。引起Ⅰ型超敏反应的物质称为过敏原,我们生活中的一些高蛋白食物、屋尘、花粉、真菌、人与动物皮毛、羽毛、昆虫、寄生虫、药物及其他化学物质等都可作为过敏原,通过吸入、食入、注射或接触使机体致敏。过敏原侵入机体后,鼻咽、扁桃体、支气管、胃肠粘膜等处固有层的浆细胞产生抗原特异性IgE,IgE通过与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE高亲和力受体（FcεRⅠ）结合,使靶细胞处于致敏状态。FcεRⅠ是一种由多个亚单位组成的膜糖蛋白,其α亚基分为细胞外区、跨膜区、胞质区三个部分,通过细胞外区的结合位点与IgE结合,是引发过敏反应的首要步骤。α亚基的细胞外区由2个免疫球蛋白样结构（D1、D2）组成,而靠近膜的环状结构是与IgE的Fc段结合的主要部位。α亚基与IgE直接结合的面由D1-D2接口的顶端（即“色氨酸脊”）以及D2域的近接口一侧所组成。FcεRⅠα链结合在IgE Fc段的2个CH3的顶端,且靠近Fc段的对称轴,锲入Fc段的两条链之间。FcεRⅠα链与2个CH3均有CH2-CH3接头（linker）的残基在受体的顶端形成1个不对称的拱形结构。当特异性抗原与靶细胞上两个以上的IgE分子结合,通过桥联反应,使两个以上的IgE分子靠近并发生构型改变。然后,交联的FcεRⅠ可激活两种胞浆内蛋白激酶（Lyn和Syk）,使之磷酸化而激活。最后,接头蛋白和GTP交换因子/GTP酶诱导胞内贮存的Ca2+释放。后者再促进细胞脱颗粒、释放血管活性物质及某些酶类,即可出现过敏反应。FcεRⅠ主要表达于嗜碱性粒细胞和肥大细胞,在嗜酸性粒细胞、单核细胞以及血小板表面也有分布,但量较前两种少的多。通过对FcεRⅠα亚基基因的研究发现,人体嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面FcεRⅠα亚基的表达受多个转录因子的调节且其C端的表达受体内IgE的影响。J.Kochan从肥大细胞系KU812提取mRNA逆转录得到的cDNA进行了α亚基氨基酸序列的预测,证实,虽然α亚基含有7个N链的糖基化位点,影响受体的分泌和稳定性,但这些糖基化位点对α链的正确折叠是非必须的,且不影响其与IgE的结合。这些为我们重组表达FcεRⅠα亚基细胞外区段提供了有力的支持。单独的α链胞外区可溶性蛋白可与IgE高亲和力结合。Dvid D等发现,去除小鼠的α亚基后,小鼠因不能表达完整的FcεRⅠ而不会发生IgE介导的Ⅰ型超敏反应。国外对过敏性疾病的研究由来已久,利用抗IgE单克隆抗体,或可溶性受体阻断或抑制Ⅰ型超敏反应的发生已成为抗过敏治疗研究的热点,目前已有商品化的抗IgE抗体用于Ⅰ型超敏反应类疾病的治疗,但利用重组人可溶性FcεRⅠα亚基来阻断其与IgE结合的方法尚未在临床上得到运用。国外有研究用哺乳动物细胞和昆虫细胞表达的马FcεRⅠα亚基胞外区可以与马肺泡灌洗液中的IgE结合。孙仁山等也利用重组可溶性FcεRⅠα亚基成功阻断了小鼠被动皮肤过敏反应。鉴于过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞含量比正常人增多,且其表面分布的FcεRⅠ量也多,本研究运用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞中成功扩增并克隆出FcεRⅠα亚基细胞外区的基因片段FcεRⅠα,将编码基因FcεRⅠα克隆至pET-28a（+）表达载体,并在大肠杆菌中进行了大量非可溶性表达,用亲和层析法纯化重组蛋白后,用透析复性的方法进行蛋白质复性,免疫小鼠制备单克隆抗体,用ELISA、细胞免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特性。结果显示,利用RT-PCR技术成功克隆了编码过敏性疾病IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基胞外区的基因,经测序并与GenBank中序列进行比对,结果完全一致,大小为696bp。并且将编码基因克隆到pET-28a（+）原核表达质粒中,经PCR、限制性酶切分析等鉴定,成功构建了FcεRⅠα-pET28a（+）重组原核表达质粒。重组质粒FcεRⅠα-pET28a（+）在大肠杆菌中表达出重组蛋白,经过表达条件的优化,表达产物主要以非可溶性形式存在。重组蛋白分子量约为23.3kDa,与理论值基本符合,表达量约占菌体总蛋白的30%。利用亲和层析法纯化重组蛋白,纯度达1 5%。用Ni亲和层析柱对蛋白进行纯化,表明该蛋白确实是所要表达的His融合蛋白。进一步用纯化的表达产物免疫小鼠制备免疫血清,ELISA和细胞免疫荧光法分析表明该免疫血清能与重组蛋白反应,而与正常小鼠血清不发生交叉反应,说明重组蛋白具有抗原活性。用纯化的表达产物免疫小鼠制备了12株单抗,以纯化重组蛋白为抗原,12株单抗培养上清的ELISA法检测,OD值为1.628～2.512。细胞免疫荧光显示其中4株能与嗜碱性粒细胞表面的天然蛋白发生特异性反应,与预计情况完全相符。说明4株单抗均为抗FcεRⅠα亚基特异性单抗。以上结果表明,我们已经成功地构建了FcεRⅠα-pET28a（+）原核重组表达质粒,而且在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性的重组蛋白;筛选并建立了多株分泌抗FcεRⅠα亚基的杂交瘤细胞株,为进一步研究该蛋白的功能、在人过敏性疾病的发生及其信号转导、对过敏性疾病的治疗奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 IgE高亲和力受体FcεRIα亚基细胞外区表达质粒的构建及鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 质粒与菌株
• 1.3 引物合成
• 1.4 血清来源
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 外周血嗜碱性粒细胞分离
• 2.3 RNA提取
• 2.4 目的基因调取
• 2.4.1 RT反应体系
• 2.4.2 PCR扩增
• 2.5 原核重组质粒FcεRIα-pMD-18T的构建
• 2.5.1 感受态细胞的制备
• 2.5.2 转化
• 2.5.3 目的基因的酶切、回收
• 2.6 融合表达载体FcεRIα-pET28a（+）的构建
• 2.6.1 目的基因片段与载体的连接
• 2.6.2 感受态细胞的制备
• 2.6.3 转化
• 2.7 重组克隆的筛选及鉴定
• 2.7.1 初步鉴定
• 2.7.2 DNA酶切鉴定
• 2.7.3 PCR鉴定
• 2.8 基因序列测定
• 3 结果
• 3.1 RT-PCR结果
• 3.1.1 扩增FcεRIα基因的琼脂糖电泳分析
• 3.1.2 PCR条件优化
• 3.2 FcεRIα-pMD18-T重组质粒的构建及鉴定
• 3.2.1 重组质粒与空载体比较鉴定图
• 3.2.2 酶切鉴定重组质粒FcεRIα-pMD18-T
• 3.2.3 测序鉴定
• 3.3 FcεRIα-pET28a（+）重组表达质粒的构建和鉴定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 重组蛋白的表达、纯化及复性
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 溶液及培养基配制
• 1.3.1 SDS-PAGE试剂
• 1.3.2 细菌培养基
• 1.3.3 目的蛋白变性液、复性液以及蛋白纯化缓冲液
• 2 方法
• 2.1 重组蛋白的诱导表达
• 2.2 蛋白表达条件的优化
• 2.2.1 最佳诱导时机的选择
• 2.2.2 最佳收菌时间的选择
• 2.2.3 最佳IPTG诱导浓度的选择
• 2.2.4 可溶性表达条件的选择
• 2.3 重组蛋白的纯化
• 2.3.1 包涵体的提取
• 2.3.2 包涵体的洗涤
• 2.3.3 变性产物的纯化
• 2.3.4 包涵体的复性
• 2.3.5 复性条件的优化
• 3 结果
• 3.1 重组质粒的表达
• 3.2 表达条件的优化
• 3.3 包含体提纯及初步洗涤
• 3.4 目的蛋白的纯化-Ni-NTA亲和纯化
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三部分 单克隆抗体的制备及鉴定
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 细胞与动物
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂配制
• 2 方法
• 2.1 抗原制备
• 2.2 动物免疫
• 2.3 效价测定
• 2.4 细胞融合
• 2.5 杂交瘤细胞株的筛
• 2.6 单克隆抗体特异性鉴定
• 2.6.1 ELISA鉴定
• 2.6.2 细胞免疫荧光鉴定
• 2.7 McAb效价测定
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 抗体的特异性鉴定
• 3.3 单克隆抗体培养上清的效价
• 4 讨论
• 5 小结
• 全文小结
• 参考文献
• 附录一:综述
• 附录二:缩略词
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢