论文摘要
研究背景和目的Exendin-4是一种从美洲希拉毒蜥（Heloderma Suspectum）唾液中提取的胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）类似物,已于2005年经美国食品药物管理局（FDA）认证获准用于2型糖尿病患者的临床治疗。与GLP－1相比,Exendin-4具有半衰期长、与受体亲和力高、易通过血脑屏障等多种优势。其与胰岛β细胞膜上的GLP-1受体（glucagon like peptide-1 receptor, GLP-1R）特异性结合后可介导血糖依赖性降糖作用、促细胞生存等多种生物学效应。GLP-1R在中枢及周围神经系统中的广泛分布,为其在神经系统疾病治疗中的应用提供了初步的理论基础。近年来的研究表明,GLP-1R激活后可促进细胞增殖分化、增强突触可塑性、抑制食欲、减轻体重、改善脂质代谢等。由此,Exendin-4的神经保护特性也日益受到人们的关注。目前Exendin-4的研究领域主要集中于神经变性疾病,而其与脑血管病的相关性研究则相对较少。神经元及胰岛β细胞均具有高度发达的内质网,对ER内稳态紊乱极为敏感。多种病理改变均可影响内质网功能,触发内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ESR）及未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。这种细胞自我保护机制同时存在于糖尿病、脑梗死,并参与了疾病的发生发展。研究发现,Exendin-4与胰岛p细胞膜上的GLP-1R特异性结合后可激活cAMP/PKA信号转导通路,抑制内质网相关性细胞凋亡。由此可以推测Exendin-4的抗凋亡机制同样适用于脑缺血再灌注损伤。如能深入探讨其相关机制,可为缺血性脑血管病的防治提供新思路。本研究旨在用原代培养的大鼠皮质神经元建立氧糖剥夺／复糖复氧（oxygen-glucose deprivation recovery, OGD/R）离体模型模拟体外神经元缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤,观察Exendin-4对体外模拟缺血冉灌注后大鼠皮质神经元ESR相关基因表达的影响,并探讨其可能机制。方法体外培养Sprague Dawley乳鼠皮质神经元,采用随机数字表法将其分为对照组、模型组、治疗组,按照MTT结果筛选出的最低有效浓度给药。其中,治疗组于建模前2 h、建模中给予Exendin-4;模型组体外模拟缺血再灌注损伤（氧糖剥夺/复供,OGD/R）;对照组给予等体积三蒸水。免疫荧光染色鉴定神经元纯度,RT-PCR检测GLP-1R mRNA表达,ELISA法检测神经元细胞内cAMP水平,MTT法测定神经元存活率,Hoechest 33258荧光染色及流式细胞术AnnexinV、PI双标法检测神经元凋亡率,real-time PCR检测C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein, CHOP）、生长抑制和DNA损伤基因34（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 34, GADD34）基因表达,免疫荧光及Western-blot免疫印迹法检测葡萄糖调节蛋白78 （glucose regulated proteins 78, GRP78）、CHOP蛋白表达。结果①Hoechest 33258检测结果显示,模型组神经元凋亡率较对照组明显增加,并随复供时间的延长而呈上升趋势（P<0.05）,镜下可见细胞凋亡发生的形态学改变（细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,荧光着色强）;②RT-PCR检测结果显示,原代大鼠皮质神经元中GLP-1R基因呈阳性表达；③ELISA结果显示,0.3μmol/1 Exendin-4作用后,皮质神经元内cAMP含量迅速增加,15 min达峰值,30 min降至基线水平（P<0.01）；④MTT结果显示,模型组神经元存活率较对照组明显下降（P<0.01）,Exendin-4干预后神经元存活率提高,在0.2～0.8μmol/1范围内呈剂量依赖性（P< 0.01）;⑤Hoechest 33258法及流式细胞术Annexin V、PI双标法检测结果均显示,ODG/R 12 h时治疗组（0.4μg/ml）细胞凋亡率明显低于模型组（P<0.01）；⑥免疫荧光及Western-blot免疫印迹结果均显示,ODG/R 12 h时模型组GRP78、CHOP蛋白表达增加（尤以CHOP为著）,Exendin-4 （0.4μg/ml）干预后GRP78表达进一步增加,CHOP表达则降低（P<0.01）；⑦real-time PCR检测结果显示,模型组CHOP mRNA、GADD34 mRNA含量随复供时间延长呈上升趋势,治疗组（0.4μg/ml） CHOP mRNA、GADD34 mRNA表达于再灌注早期即迅速上升,再灌注8h达峰值,后期下降（P<0.05）;⑧Western-blot免疫印迹分析结果均显示,模型组GRP78、CHOP蛋白表达随复供时间延长呈上升趋势,治疗组（0.4μg/ml）GRP78蛋白表达进一步增加（各时间点均高于模型组）,CHOP蛋白表达则在氧糖复供早期迅速上升,达峰值后降至模型组水平以下（P<0.05）结论①体外模拟缺血再灌注（OGD/R）损伤可诱导大鼠皮质神经元发生细胞凋亡；②内质网凋亡通路是缺血再灌注损伤后神经元死亡的病理机制之一；①Exendin-4可缓和内质网应激,进而抑制损伤后神经元凋亡的发生；④Exendin-4神经保护机制可能是通过干预UPR通路,加强PSI负反馈环路实现的。