水蛭素的分离纯化及其聚乙二醇修饰

论文摘要

水蛭素是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂,本文对天然水蛭素的提取纯化以及聚乙二醇修饰展开研究,并对修饰产物的性质进行初步探索。目前人们对于天然水蛭素的提取进行了大量的研究,本文在水蛭素纯化过程中,对水蛭预处理、粗提和纯化步骤进行了研究。在水蛭预处理中比较了微波、缓冲液提取、烘干、冻干四种方法,证实微波法可导致水蛭素失活,后三种方法对于水蛭素活力保留没有差别。在粗提过程中,采用pH选择法可以很好地使水蛭素活力保留,粗提液比活力为3.19 ATU/mg。使用离子交换以及凝胶过滤层析法纯化粗提液,经离子交换层析后得到产物比活为9.1×103 ATU/mg。经SDS-PAGE电泳分析证实得到水蛭素纯度较高。作为最强的凝血酶抑制剂,水蛭素存在体内半衰期短等的药用缺点。聚乙二醇修饰是目前有效地延长其半衰期的方法。本文用琥珀酰亚胺活化的mPEG 5kDa和mPEG 20kDa对水蛭素进行化学修饰。比较了两种方式即液相与离子交换树脂辅助的固相修饰的结果。并优化PEG 20 kDa固相修饰的反应条件为pH 8 PBS,HV2/SC-PEG摩尔比1:9,反应60min。PEG 5 kDa与PEG 20 kDa修饰相比较,产物产率较高,而单一性较低。离子交换层析结果表明,固相修饰分离度优于液相反应,且产品单一性较高,但是转化率低于液相反应。体外抗凝活性分析表明,固相反应中,无论是PEG 5 kDa,还是PEG 20 kDa修饰,活力保留率都远远高于液相反应。另外,PEG 5 kDa修饰产物活力保留率均低于相同反应方式下PEG 20 kDa的修饰产物。分子动力学模拟方法预测固相修饰反应中修饰产物的修饰位点为K35。通过凝胶层析分析液相修饰产物,多修饰产物并不稳定,可以降解为修饰度更低的产物,单修饰产物较为稳定。修饰后水蛭素所增加的表观分子量为连接PEG分子量的4.4～6.2倍之间。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 水蛭素研究现状及其聚乙二醇修饰
• 1.1 水蛭素结构和理化性质
• 1.1.1 水蛭素的结构
• 1.1.2 水蛭素的理化性质
• 1.2 水蛭素的分离纯化
• 1.2.1 天然水蛭素的分离纯化
• 1.2.2 重组水蛭素的分离纯化
• 1.3 水蛭素的药理作用和药代动力学
• 1.3.1 水蛭素的药理作用
• 1.3.2 水蛭素的药代动力学
• 1.4 水蛭素的聚乙二醇修饰
• 1.4.1 蛋白类药物聚乙二醇修饰研究进展
• 1.4.2 蛋白类药物聚乙二醇固相修饰
• 1.4.3 水蛭素的聚乙二醇修饰
• 1.5 水蛭素聚乙二醇修饰产物分离与纯化
• 1.5.1 聚乙二醇化蛋白质的分离纯化
• 1.5.2 水蛭素聚乙二醇修饰产物分离与纯化
• 1.6 聚乙二醇修饰产物检测与分析
• 1.6.1 色谱法
• 1.6.2 电泳法
• 1.6.3 其他方法
• 1.7 水蛭素的体外抗凝活性的检测方法
• 1.7.1 凝血酶直接滴定法
• 1.7.2 Chromonym TH为生色底物的比色法
• 1.7.3 光散射法
• 1.8 本文的研究思路
• 2 天然水蛭素的提取及纯化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 水蛭的预处理
• 2.3.2 粗提方法的选取
• 2.3.3 水蛭素纯化
• 2.3.4 水蛭素纯度鉴定（SDS-PAGE）
• 2.3.5 水蛭素含量测定
• 2.3.6 水蛭素活力测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 预处理方法对水蛭素活力的影响
• 2.4.2 粗提方法的选取
• 2.4.3 水蛭素的纯化
• 2.4.4 水蛭素纯度鉴定（SDS-PAGE）
• 2.5 小结
• 3 聚乙二醇修饰水蛭素及其分离与分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 液相PEG修饰水蛭素
• 3.3.2 离子交换柱辅助PEG修饰水蛭素
• 3.3.3 离子交换柱辅助PEG 20 kDa修饰水蛭素条件优化
• 3.3.4 离子交换柱辅助PEG连续修饰水蛭素
• 3.3.5 电泳（SDS-PAGE）
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 液相PEG修饰水蛭素
• 3.4.2 离子交换柱辅助PEG修饰水蛭素
• 3.4.3 离子交换柱辅助PEG 20 kDa修饰水蛭素条件优化
• 3.4.4 离子交换柱辅助PEG连续修饰水蛭素
• 3.5 小结
• 4 聚乙二醇修饰产物性质的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 修饰产物活力测定
• 4.3.2 修饰产物蛋白浓度测定
• 4.3.3 修饰产物凝胶柱行为研究（表观分子量）
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 修饰产物比活测定
• 4.4.2 修饰产物凝胶柱行为研究
• 4.4.3 修饰位点预测
• 4.5 小结
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢