禽呼肠孤病毒S3、S4基因的克隆与序列分析

论文摘要

本试验提取禽呼肠孤病毒内蒙古、天津地区分离株（B-98、C-98、G-98、T-98株）病毒总RNA。参考GenBank中禽呼肠孤病毒S3、S4基因序列设计2对引物。应用RT-PCR技术特异性地扩增病毒的S3、S4基因。将纯化的目的DNA与PMD19-T载体连接,转化到DH5α感受态细胞中,应用蓝白斑法筛选阳性重组质粒,然后用PCR法鉴定重组质粒,将鉴定的阳性重组菌送生物工程公司测定S3、S4基因序列,应用计算机软件将测定序列与参考序列进行比较。结果表明测定的S3基因节段长1202bp,均包含完整的开放性阅读框（Open Reading Frame,ORF）,位于31～1134 bp;S4基因节段长1109bp,包含完整的开放性阅读框（ORF）,位于2～1105 bp。禽呼肠孤病毒B-98、C-98、G-98和T-98的S3基因序列已成功登录GenBank,登录号分别为EF030498、EF030496、EF030497、EF030499。四个分离株的S3基因与禽呼肠孤病毒S1133、176和鸡源番鸭呼肠孤病毒YJL的同源性很高在99.2%～100%之间;与禽呼肠孤病毒138的同源性较高在87.0%～87.3%之间;与番鸭呼肠孤病毒S14和89026的同源性较低在60.0%～64.1%之间;与哺乳动物呼肠孤病毒3和纳尔逊海湾病毒的同源性很低分别为3.8%和19.2%。四个分离株的S4基因与禽呼肠孤病毒S1133、176和鸡源番鸭呼肠孤病毒YJL的同源性很高在98.8%～99.6%之间;与禽呼肠孤病毒138和番鸭呼肠孤病毒S14和89026的同源性较高在76.4%～81.2%之间;与哺乳动物呼肠孤病毒3和纳尔逊海湾病毒的同源性很低分别为6.5%～6.6%和53.9%～56.2%。S3和S4基因系统发生树分析表明,均与禽呼肠孤病毒S1133、176和鸡源番鸭呼肠孤病毒YJL的遗传进化关系最近,分属同一进化分支。天津、内蒙古分离株的σB蛋白和σNS蛋白结构分析表明,它们均为亲水蛋白,等电点在6.27～7.10之间。天津、内蒙古分离株σB蛋白和σNS蛋白抗原位点与禽呼肠孤病毒S1133、176和鸡源番鸭呼肠孤病毒YJL相同。综上所述,禽呼肠孤病毒内蒙古、天津地区分离株S3和S4基因的抗原位点分析结果与同源性、系统发生树结果相互一致,与禽呼肠孤病毒S1133、176和鸡源番鸭呼肠孤病毒YJL的同源性最高,分属同一进化分支,且抗原位点相同。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 禽呼肠孤病毒感染概述
• 1.2 病原学
• 1.2.1 分类、形态与特性
• 1.2.2 化学组成
• 1.2.3 抗原性
• 1.2.4 培养特性
• 1.2.5 致病性
• 1.2.6 抵抗力
• 1.2.8 病毒基因组及编码蛋白质的功能
• 1.3 流行病学
• 1.3.1 易感动物
• 1.3.2 传染源
• 1.3.3 传播途径
• 1.4 临床症状
• 1.5 病理变化
• 1.6 诊断
• 1.7 防治
• 1.8 本论文研究依据及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验用病毒株
• 2.1.2 参考毒株序列
• 2.1.3 菌株及质粒
• 2.1.4 主要试剂以及试剂盒
• 2.1.5 试验所用溶液及其配制
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 病毒 RNA 的提取
• 2.2.3 病毒目的基因的一步法 RT-PCR 扩增
• 2.2.4 病毒目的基因的克隆
• 2.2.5 质粒DNA 测序
• 2.2.6 基因序列拼接
• 2.2.7 序列比较分析
• 3 结果
• 3.1 病毒目的基因的一步法 RT-PCR 扩增结果
• 3.1.1 S3 基因的一步法 RT-PCR 扩增结果
• 3.1.2 S4 基因的一步法 RT-PCR 扩增结果
• 3.2 重组质粒的 PCR 鉴定结果
• 3.2.1 S3 基因的重组质粒的PCR 鉴定
• 3.2.2 S4 基因的重组质粒的PCR 鉴定
• 3.3 序列的测定结果
• 3.3.1 S3 基因序列测定结果
• 3.3.2 S4 基因序列测定结果
• 3.4 序列分析结果
• 3.4.1 S3 基因序列分析
• 3.4.2 S4 基因序列分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介