肺炎支原体黏附蛋白P1羧基末端的克隆表达及检测

论文摘要

肺炎支原体（Mycoplasma Pneumoniae,MP）是引起人类非典型肺炎和多种呼吸道感染的病原体之一,人感染后还会引起心肌损害、神经系统损害、肾脏损害、传染性单核细胞增多症、川崎病等并发症。肺炎支原体对青霉素类药物不敏感,只对大环内酯类、四环素类药物敏感。因此,尽早检测出肺炎支原体感染,对有效治疗由其引发的疾病具有重要意义。肺炎支原体能感染人关键是其可以黏附人的呼吸道上皮细胞,而黏附蛋白P1是肺炎支原体的主要黏附蛋白,也是肺炎支原体的主要免疫原,在P1羧基末端含有多个抗原决定簇。本研究以肺炎支原体FH株基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得黏附蛋白P1基因羧基末端部分编码序列,再将其克隆到克隆载体pEASY-T1上,进而得到了pEASY-MP-P1F这一重组质粒。后续实验对pEASY-MP-P1F进行基因测序检查,把测序结果正确的P1F基因克隆到表达载体pET32a（+）上,构建pET32a-MP-P1FE这一重组表达质粒。接着对pET32a-MP-P1FE中的P1FE进行测序,检测正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,以Ni2+亲和层析柱对pET32a-MP-P1FE表达的重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的重组蛋白相对分子质量为50kDa至60kDa,与预计值55.9kDa一致。Western Blotting、ELISA免疫检测证实,重组蛋白与感染肺炎支原体病人血清中的抗体有特异性反应。因此,此次研究成功克隆表达了具有免疫原性的黏附蛋白P1羧基末端基因,为进一步研究开发肺炎支原体诊断试剂和疫苗等奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 肺炎支原体简介
• 1.2 肺炎支原体的致病性
• 1.3 肺炎支原体的黏附作用
• 1.4 肺炎支原体的黏附蛋白
• 1.4.1 P1 蛋白
• 1.4.2 P30 蛋白
• 1.4.3 P116 蛋白
• 1.4.4 P65 蛋白
• 1.4.5 粘附辅助蛋白
• 1.4.5.1 HMW1、HMW2、HMW3
• 1.4.5.2 蛋白B、C
• 1.5 肺炎支原体感染的诊断
• 1.6 本课题的研究内容及意义
• 第二章 肺炎支原体 P1 基因的克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 载体及大肠杆菌
• 2.1.3 酶类试剂及常用试剂盒
• 2.1.4 主要实验药品
• 2.1.5 实验溶液配制
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 引物的设计与合成
• 2.3.2 基因组的抽提
• 2.3.3 PCR 扩增目的基因P1
• 2.3.4 PCR 产物的回收
• 2.3.5 用回收的PCR 产物构建克隆载体（pEASY-MP-P1F）
• 2.3.6 连接产物的转化
• 2.3.7 阳性重组子的鉴定及测序
• 2.3.7.1 菌液PCR 方法鉴定阳性重组子
• 2.3.7.2 重组克隆质粒（pEASY-MP-P1F）的提取
• 2.3.7.3 重组克隆质粒的酶切鉴定
• 2.3.7.4 重组克隆质粒的测序鉴定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 肺炎支原体基因组抽提
• 2.4.2 目的基因P1 的PCR 扩增
• 2.4.3 重组克隆质粒的鉴定
• 2.4.3.1 菌液PCR 方法鉴定阳性重组子
• 2.4.3.2 重组克隆质粒的提取
• 2.4.3.3 重组克隆质粒的酶切鉴定
• 2.4.3.4 重组克隆质粒的测序分析
• 2.5 小结
• 第三章 肺炎支原体 P1 基因的表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 载体及大肠杆菌
• 3.1.2 酶类试剂及常用试剂盒
• 3.1.3 主要实验药品
• 3.1.4 实验溶液配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 设计带酶切位点的引物
• 3.2.2 PCR 扩增目的基因P1
• 3.2.3 构建表达载体（pET32-MP-P1FE）
• 3.2.3.1 酶切
• 3.2.3.2 酶切产物的回收
• 3.2.3.3 连接
• 3.2.4 用氯化钙法制备大肠杆菌TOP10 感受态细胞
• 3.2.5 连接产物转化感受态细胞
• 3.2.6 重组表达质粒的鉴定
• 3.2.6.1 菌液PCR 方法鉴定阳性重组子
• 3.2.6.2 重组表达质粒（pET32-MP-P1FE）的提取
• 3.2.6.3 重组表达质粒的酶切鉴定
• 3.2.6.4 重组表达质粒的测序分析
• 3.2.7 用重组表达质粒转化表达菌株
• 3.2.8 重组表达质粒的诱导表达
• 3.2.8.1 检测目的蛋白的表达
• 3.2.8.2 SDS-PAGE 鉴定步骤
• 3.2.8.3 目的蛋白的可溶性分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 目的基因的获得及菌液PCR 鉴定
• 3.3.2 表达载体的酶切和测序鉴定
• 3.3.3 目的蛋白的表达及可溶性分析
• 3.3.3.1 检测目的蛋白
• 3.3.3.2 可溶性分析
• 3.4 小结
• 第四章 目的蛋白纯化及免疫学检测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 酶类试剂及常用试剂盒
• 4.1.2 实验溶液配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 纯化目的蛋白
• 4.2.2 免疫学检测纯化后的蛋白
• 4.2.2.1 Western Blotting 免疫印迹检测
• 4.2.2.2 ELISA 免疫检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 目的蛋白纯化
• 4.3.2 免疫检测
• 4.3.2.1 Western Blotting 检测结果
• 4.3.2.2 ELISA 检测结果
• 4.4 小结
• 第五章 结论和展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 （硕士期间发表的论文）