力生长因子的制备与功能研究

论文摘要

力生长因子（Mechano growth factor, MGF）是一种新发现的生长因子,由Igf-1基因剪接变异产生。该生长因子在拉伸刺激的骨骼肌或损伤的肌肉、神经等组织中表达被提高。进一步的研究表明:MGF及其E肽（MGF-Ct24E）具有促进肌肉肥大、修复损伤的功能,因而对相关疾病可能具有治疗作用。但迄今为止,该蛋白还没有进行理化性质和生物学功能的直接研究,原因在于尚未获得MGF蛋白样品。我们实验室在以往的研究中发现,MGF mRNA在拉伸刺激的成骨细胞中高表达,提示该因子也可能是骨组织中的力响应分子,并对成骨细胞的功能产生影响。这方面的研究目前还未见其他研究人员的报道。所以本课题首先开展MGF以及MGF-Ct24E的制备,并进一步研究它们对成骨细胞功能的影响。研究目的:构建适合中试化生产的MGF和MGF-Ct24E大肠杆菌表达系统,建立一套有效的蛋白纯化工艺,制备满足实验需要的蛋白样品。制备MGF特异性多克隆抗体,用于分析拉伸刺激后成骨细胞内MGF蛋白质的表达。构建携带Mgf和Igf-1基因的重组腺病毒。通过生长因子直接作用和基因转染,研究MGF及其E肽对成骨细胞增殖、迁移、分化的影响,并分析其相关机制。研究方法:以MGF DNA为模版,PCR扩增携带限制性内切酶位点和标签序列的截短型MGF（des（1-3）MGF）和MGF-Ct24E的重组序列,分别插入质粒pMAL-c2x并转化大肠杆菌BL21,发酵表达融合蛋白MBP/des（1-3）MGF和MBP/MGF-Ct24E,通过离子交换层析和金属亲和层析等技术纯化融合蛋白,经肠激酶酶切,rpHPLC去除MBP后,获纯净的des（1-3）MGF和MGF-Ct24E样品。质谱测定样品分子量,等电聚焦测定等电点进行鉴定。MGF-Ct24E作抗原免疫动物,制备MGF特异性抗体,并利用抗体进行western blot分析拉伸刺激下MGF在成骨细胞中的表达变化,免疫荧光细胞技术分析MGF在细胞内的分布特点。构建携带Mgf和Igf-1基因的腺病毒转染系统,感染成骨细胞株MC3T3-E1。通过多肽直接作用和基因转染研究MGF、MGF-Ct24E以及IGF-1对成骨细胞增殖、迁移、分化的影响,结合抑制剂PD98059、LY294002的使用,分析信号通路MAPK-Erk1/2和PI3K-Akt与MGF功能的关联。细胞增殖通过MTT法检测,流式细胞仪分析细胞周期;Millicell-PCF细胞培养小室分析多肽作用下细胞的迁移;碱性磷酸酶活性、胞外基质蛋白表达、钙沉积分析评价细胞分化。研究结果:1、将des（1-3）MGF、MGF-Ct24E的重组序列克隆入PMAL-c2x质粒,构成重组质粒pMGF和pMGF24E,重组质粒转化BL21,在IPTG的诱导下成功表达融合蛋白MBP/ des（1-3） MGF和MBP/MGF-Ct24E。2、补料分批发酵制备重组蛋白,工艺优化后确定采用M9-YE培养基,含天然有机氮源的补料液,37°C,30%溶氧发酵,0.2mM IPTG诱导蛋白表达。MBP/ des（1-3）MGF包含体占细菌总蛋白30%,MBP/MGF-Ct24E可溶蛋白占细菌总蛋白的35%。柱层析法可以获得纯度95%以上的融合蛋白,包含体复性率80%以上。融合蛋白经EK酶切,rpHPLC分离获得纯度达98%以上的目的蛋白des（1-3）MGF和MGF-Ct24E,质谱鉴定二者的分子量与理论值相符。3、MGF-Ct24E免疫4次获得含特异性抗体的兔血清,经纯化后的抗体,western blot鉴定具有抗MGF特异性。Western blot分析显示拉伸刺激成骨细胞6、12、24h,MGF的表达量分别是对照组的2.7、5.2、1.1倍。免疫荧光检测发现MGF具有核分布特性。4、构建了携带Mgf和Igf-1基因的重组腺病毒,成功感染成骨细胞MC3T3-E1,实现两种生长因子的高水平表达。5、MGF （des（1-3）MGF）、MGF-Ct24E、IGF-1三种多肽作用成骨细胞MC3T3-E1。分析细胞增殖和迁移发现,MGF-Ct24E和MGF具有比IGF-1更显著的促进细胞增殖的作用。三种生长因子都对成骨细胞有趋化作用,其中MGF最强,而MGF-Ct24E最弱。MGF-Ct24E和MGF的促增殖作用与其显著激活MAPK-Erk1/2途径有关,促迁移能力部分的与MAPK-Erk1/2和PI3K-Akt活化有关,其中PI3K-Akt处于主要地位。6、细胞分化检测发现,MGF-Ct24E和MGF具有延迟成骨细胞分化的作用。1nM的多肽处理,MGF-Ct24E和MGF在细胞分化早期降低了ALP活性,而IGF-1表现出促进作用,在分化晚期MGF-Ct24E对细胞的矿化也表现出抑制作用,而MGF没有这种效应。另外MGF-Ct24E和MGF抑制了Col1的表达,但提高了OPN的表达。MGF-Ct24E和MGF对成骨细胞分化的延迟效应与Erk1/2的激活有关,抑制Erk1/2活化,ALP的表达被逆转,而MGF和IGF-1激活Akt促进了细胞分化。进一步研究发现MGF-Ct24E和MGF对转录因子Cbfα-1的核转运有抑制作用,这可能是细胞分化受到抑制的原因之一。结论:本研究成功构建了MGF和MGF-Ct24E的大肠杆菌表达系统,并实现了发酵表达,建立了一套完整的重组蛋白纯化和复性工艺,证明MGF可以通过原核表达的方式获得。获得的MGF-Ct24E可以免疫动物获得抗MGF特异性抗体,利用该抗体通过western blot分析,在蛋白质水平证实拉伸刺激能够刺激成骨细胞表达MGF。通过细胞实验发现,MGF及其E肽具有显著的促进成骨细胞增殖的作用,但对分化表现出一定的延迟,这些功能与E肽显著激活MAPK-Erk1/2有关,而MGF还具有显著激活Akt的能力,Akt活化促进了细胞迁移并且是成骨细胞分化所必须的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词列表
• 1 绪论
• 1.1 研究意义与背景
• 1.2 MGF 研究现状
• 1.2.1 Igf-1 基因结构与表达特点
• 1.2.2 MGF 产生机制
• 1.2.3 MGF 的功能
• 1.2.4 MGF 可能的结构和理化性质
• 1.3 本研究的目的和研究内容
• 1.3.1 本研究的目的
• 1.3.2 本研究的主要内容
• 2 MGF 及其E 肽原核表达系统的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 PCR 扩增des（1-3）MGF 和MGF-Ct24E 基因片段
• 2.3.2 重组质粒的构建和鉴定
• 2.3.3 重组蛋白的表达
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 重组蛋白的发酵表达及纯化鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 发酵表达
• 3.3.2 包含体的洗涤
• 3.3.3 重组蛋白柱层析纯化
• 3.3.4 酶切，精纯化及鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 多克隆抗体的制备及MGF 在成骨细胞中的表达分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 抗体制备
• 4.3.2 抗体专一性鉴定
• 4.3.3 拉伸刺激后成骨细胞中MGF 蛋白水平的变化
• 4.3.4 MGF 在细胞内的定位分析
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 Ad/MGF、Ad/IGF-1 的构建及细胞感染
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 pAdTrac-MGF、pAdTrac-IGF-1 的构建
• 5.3.2 pAdEasy-MGF、pAdEasy-IGF-1 的构建
• 5.3.3 重组腺病毒包装、鉴定和滴度测定
• 5.3.4 重组腺病毒感染MC3T3-E1 和MGF、IGF-1 表达鉴定
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 6 MGF 及其E 肽对MC3T3-E1 增殖、迁移的影响
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 MTT 法测细胞增殖
• 6.3.2 细胞周期分析
• 6.3.3 细胞迁移分析
• 6.3.4 MGF 及其E 肽对Erk1/2、Akt 活化磷酸化的影响
• 6.3.5 抑制Erk1/2、Akt 活化对多肽功能的影响
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 7 MGF 及其E 肽对MC3T3-E1 分化矿化的影响
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 方法
• 7.3 结果
• 7.3.1 ALP 活性分析
• 7.3.2 基质蛋白 Col1、OPN 及转录因子 Cbfα-1 的表达
• 7.3.3 矿化染色和钙沉淀定量分析
• 7.4 讨论
• 7.5 本章小结
• 8 结论与展望
• 8.1 主要结论
• 8.2 课题创新性
• 8.3 未来工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 MGF 的氨基酸组成
• 附录2 pMGF 测序结果
• 附录3 溶液配制
• 附录4 论文工作