论文摘要
目的:观察基质金属蛋白酶-3（MMP-3）启动子区域-1612位点5A/6A基因多态性对MMP-3转录活性的影响,从而阐述其与经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄的关系,并通过动物实验的方法探讨MMP-3组织型金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）在动脉损伤后再狭窄发生中的作用,进而为进一步降低PCI术后再狭窄率探求一种可能的基因治疗途径。方法:1.随机入选自2005年6月至2007年6月,PCI术后于我院复查冠脉造影患者261例,平均随访时间24.83±4.11月,依据复查冠脉造影结果将患者分为对照组（n=105）和再狭窄组（n=156）。分别提取每名患者染色体DNA,设计特定的引物,采用PCR方法扩增MMP-3启动子区域含-1612位点130bp基因片段,以限制性核酸内切酶Tth111I（GACN/NNGTC）进行酶切,根据酶切后琼脂糖凝胶电泳结果将MMP-3基因型分为野生型（6A/6A）（n=180）和突变型（5A/6A+5A/5A）（n=81）,观察患者临床资料和MMP-3启动子区域基因多态性与再狭窄的关系。2.再狭窄组基因型中选取携带MMP-3启动子区域含-1612位点5A/5A和6A/6A纯合子基因,经PCR扩增该片段后,将扩增后片段与pUCm-T载体进行连接,构建pUCm-T/5A重组质粒和pUCm-T/6A重组质粒,限制性核酸内切酶和DNA测序确认序列正确后,连接pGL2-Basic载体,构建pGL2-Basic/5A和pGL2-Basic/6A重组质粒,采用相同的方法测序正确后,用阳离子脂质体转染技术,将重组质粒转染到HepG2细胞,进行体外细胞培养。收集细胞测定细胞中荧光素酶报告基因的强度来反映MMP-3表达水平。3.构建MMP-3组织型抑制剂TIMP-1的重组腺病毒载体,通过经左侧颈外动脉穿刺留置针方法拉伤大鼠左侧颈总动脉建立大鼠颈动脉损伤后再狭窄模型,随机分为空白对照组（不施加任何干预因素）、AdCMV组（对照组,AdCMV转染组）、AdhTIMP-1组（实验组,AdhTIMP-1转染组）,实验组拉伤颈总动脉后给予携带重组人TIMP-1基因的腺病毒进行干预,对照组给予单纯腺病毒进行干预,而空白对照组仅给予相同剂量的生理盐水。随后三组大鼠均饲以高脂饮食。2周后,分别留取血清进行血液学指标检测,并留取左侧颈动脉标本,通过HE染色观察动脉损伤后再狭窄形成的情况及免疫组化方法观察大鼠颈动脉损伤部位MMP-3和TIMP-1表达情况。结果:采用Logistic回归分析发现,病变血管类型、参考血管直径和支架类型与晚期再狭窄明显相关（p=0.040、0.006、0.007）,而其他因素对照组和再狭窄组之间未见统计学差异。而按基因型分组后,虽然两组之间再狭窄发生率未见统计学差异（p=0.218）,但野生型基因组较突变型基因组血管狭窄程度明显加重（p=0.047）。另外从基因频率角度而言,携带6A等位基因型患者发生再狭窄的机率明显高于携带5A等位基因型患者（p＜0.001）。扩增特定的MMP-3启动子区域并成功构建pGL2-Basic/5A和pGL2-Basic/6A质粒,随后转染到HepG2细胞观察发现,荧光素酶报告基因在两种载体中均得到了高效的表达。而突变型pGL2-Basic/5A重组质粒荧光素酶相对活性明显高于野生型pGL2-Basic/6A重组质粒。动物实验给予大鼠高脂饮食后我们发现,2周后,三组大鼠血清总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平较基础状况明显增加,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）则明显减低。HE染色可见对照组和空白对照组中膜厚度较实验组有所增加,虽内膜中膜厚度比（IMT）和管腔内径与对照组相比未见统计学差异。但是,通过免疫组化发现对照组和空白对照组动脉损伤局部MMP-3水平明显高于实验组,而实验组TIMP-1水平则明显高于对照组和空白对照组。结论:对于直径小于3mm的C型病变血管,PCI时应用裸支架较其他类型病变及应用药物涂层支架而言更容易发生再狭窄。由于体外实验证实MMP-3启动子区域6A等位基因表达活性低于5A等位基因,因此结合临床资料得出MMP-3基因启动子-1612bp位点基因多态性差异可能与PCI术后再狭窄有关。而通过携带MMP-3组织型抑制剂重组人TIMP-1的腺病毒成功转染大鼠颈动脉血管壁细胞方法,能够抑制血管损伤后MMP-3表达,干预动脉损伤后再狭窄的进程,从而推测携带重组人TIMP-1腺病毒载体今后可能会作为治疗冠心病的一种基因治疗手段,进一步减低再狭窄的发生。