RNAi沉寂肝癌细胞CDK2基因表达及树舌多糖GF辅助作用的研究

论文摘要

目的:构建针对CDK2的siRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株SMMC7721,研究其对肝癌CDK2基因及细胞周期相关基因（RB、CyclinE、E2F1）表达的影响,以及树舌多糖GF对其的辅助作用。方法:用基因克隆技术构建针对CDK2基因的siRNA真核表达载体,阳离子脂质体试剂法转染肝癌细胞株SMMC7721,实时荧光定量PCR与Western blot技术检测对CDK2基因的抑制效果并筛选出有效siRNA序列片段;并用实时荧光定量PCR技术研究RNAi抑制CDK2对细胞周期相关基因RB、CyclinE、E2F1的mRNA水平的影响;MTT法检测树舌多糖GF体外对SMMC7721细胞增殖抑制情况并筛选出体外抗瘤的有效树舌多糖GF剂量;并采用实时荧光定量PCR与Western blot技术研究树舌多糖GF对肝癌SMMC7721细胞CDK2、RB、CyclinE、E2F1基因表达的影响并探讨该多糖对RNAi抑制CDK2基因的辅助作用。结果:1.DNA测序证明成功构建针对CDK2基因的siRNA真核表达载体。2.阳离子脂质体转染法成功将外源表达载体转入SMMC7721细胞,转染效率达90%以上。3.肝癌细胞CDK2基因的有效siRNA干扰片段为190:GGAGCTTAACCATCCTAATAT与191:GACCCTAACAAGCGGATTTCG。4.siRNA真核表达载体可以在mRNA与蛋白水平特异地阻断SMMC7721细胞CDK2基因的表达,其中190、191对CDK2基因mRNA水平的抑制率分别为72%、56%,对CDK2基因蛋白水平的抑制率分别为91.6%、79.5%。5.RNAi抑制CDK2对细胞周期相关基因表达有影响,190片段使RB基因mRNA表达上调56%,191片段可使CyclinE与E2F1基因mRNA表达分别下调36%、38%。6.树舌多糖GF 2.5μg·mL-1、5μg·mL-1、10μg·mL-1对肝癌细胞增殖有明显抑制作用,抑制率分别为20.01%、20.47%、24.44%。7.树舌多糖GF2.5μg·mL-1、10μg·mL-1可使CDK2、CyclinE、E2F1基因mRNA表达水平下调,使RB基因mRNA表达水平上调。8.树舌多糖GF10μg·mL-1与190序列合用使CDK2蛋白表达比单纯190抑制提高47.1%;树舌多糖GF2.5μg·mL-1与191序列合用使CDK2mRNA表达比单纯191抑制提高3%,蛋白表达比单纯191抑制提高13.3%。结论:1.经DNA测序证明,成功构建6对以CDK2为靶基因的siRNA真核表达载体。2.通过RNAi能特异地沉寂肝癌细胞中CDK2基因,表明CDK2基因可能成为肝癌基因治疗中的一个新的靶点。3.肝癌细胞中RB、CyclinE、E2F1基因的mRNA表达对CDK2基因的表达有明显的依赖性,表明对细胞周期调控网络中CDK2基因的干扰抑制是肝癌基因治疗的有效手段之一。4.树舌多糖GF对体外肝癌细胞株SMMC7721的增殖有明显抑制作用,机制可能是通过下调CDK2、CyclinE与E2F1基因表达,上调RB基因表达实现的。5.树舌多糖GF对RNAi沉寂CDK2基因表达有一定辅助作用,表明树舌多糖GF可以成为肝癌基因治疗中的一个新的辅助药物。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献综述
• 一 RNAi研究进展
• 二 细胞周期及细胞周期调控
• 三 中药多糖抗肿瘤研究进展
• 四 树舌多糖GF研究进展
• 五 展望
• 实验研究
• 第一部分 CDK2基因siRNA真核表达载体的构建与筛选鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 RNAi特异性敲除肝癌细胞CDK2基因表达的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 RNAi沉寂肝癌细胞CDK2基因对RB、CyclinE、E2F1基因表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 树舌多糖GF对肝癌细胞株SMMC7721的增殖抑制作用及其作用机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第五部分 树舌多糖GF对RNAi沉寂CDK2基因的辅助作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读博士学位期间的研究成果及发表的论文