坏死梭杆菌斑马鱼感染模型的建立及免疫保护试验

论文摘要

坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum，FN）是引起人类和动物发生多种坏死性、化脓性疾病的原发性或继发性病原，其中牛、羊肝脓肿和腐蹄病严重影响家畜生产性能。本研究以致病性坏死梭杆菌为研究对象，筛选适于坏死梭杆菌生长的培养基，同时采用组织病理学、分子生物学等方法，建立了坏死梭杆菌—斑马鱼感染模型，并利用该模型对坏死梭杆菌主要抗原免疫保护研究进行了初步探索。（1）培养基筛选试验：对比坏死梭杆菌常用的三种培养基，发现心脑浸液（brain heartinfusion，BHI）为坏死梭杆菌FN（AB）的适合培养基。利用分光光度计法和细菌计数测定坏死梭杆菌FN（AB）的迟缓期为0～12h，12h～24h为其对数生长期，24h后进入稳定期和衰亡期。（2）斑马鱼感染试验：选取健康野生斑马鱼，腹腔内接种坏死梭杆菌FN（AB）（10μL/尾）,然后置于恒温水族箱（29±1℃）内饲养，连续观察7d，记录斑马鱼发病与死亡情况。按照Reed-munch法计算出FN（AB）的半数致死量为1.06×106cfu；接种12h后，斑马鱼陆续出现死亡；剖检可见淡黄色腹水，肠道轻微出血和肝脏肿大症状；组织病理学结果显示斑马鱼的肝脏、肾脏发生坏死性病变，肠道黏膜脱落；从斑马鱼病变组织中可以分离到坏死梭杆菌。因此证实，斑马鱼可以作为研究坏死梭杆菌FN（AB）发病机理的动物模型。（3）斑马鱼抗FN（AB）感染的保护试验：选取健康的野生斑马鱼，分别腹腔注射FN裂解抗原和抗FN抗血清，10μL/尾，对照组注射等量生理盐水，7d后同法进行第二次注射，第28d以50LD50剂量的FN（AB）培养物实验性攻击斑马鱼，结果显示对照组全部死亡，接种坏死梭杆菌裂解抗原组和抗坏死梭杆菌抗血清的试验组的相对保护率（RSP）分别为44%和46.7%，表明裂解抗原和抗血清对斑马鱼有一定的保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 坏死梭杆菌的研究现状
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 病原学
• 1.1.3 流行病学
• 1.1.4 坏死梭杆菌对家畜和人的感染
• 1.1.5 检测方法
• 1.1.6 动物模型
• 1.1.7 致病机理
• 1.1.8 坏死梭杆菌病的预防和控制
• 1.2 斑马鱼作为模式生物的应用
• 1.2.1 斑马鱼生物学特征
• 1.2.2 斑马鱼作为感染模型的应用
• 1.2.3 斑马鱼作为模式生物的优势和缺陷
• 第二章 坏死梭杆菌 FN（AB）生长培养基的选择及生长曲线的测定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养基制备
• 2.2.2 菌种的活化
• 2.2.3 三种培养基的生长情况的比较
• 2.2.4 BHI 培养基生长曲线的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 三种培养基生长情况的比较
• 2.3.2 BHI 培养基生长曲线的测定
• 2.4 讨论
• 第三章 坏死梭杆菌斑马鱼感染模型的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 斑马鱼
• 3.1.3 酶及其它试剂
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌株的培养
• 3.2.2 细菌稀释及斑马鱼的攻毒
• 3.2.3 斑马鱼半数致死量的测定
• 3.2.4 接种斑马鱼的病理学检测
• 3.2.5 细菌的分离与鉴定
• 3.2.6 分离菌的致病力实验
• 3.2.7 动物回归试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 斑马鱼临床及病理变化
• 3.3.2 LD50的计算
• 3.3.3 细菌的分离与鉴定
• 3.3.4 动物回归试验
• 3.3.5 分离菌的致病力实验
• 3.4 讨论
• 第四章 斑马鱼抗坏死梭杆菌的免疫保护试验
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株及斑马鱼
• 4.1.2 血清
• 4.2 方法
• 4.2.1 裂解抗原的制备
• 4.2.2 斑马鱼的主动免疫保护试验
• 4.2.3 斑马鱼的被动免疫保护试验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 安全性试验
• 4.3.2 相对保护率测定结果
• 4.4 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介