水稻白叶枯病菌群体感应信号DSF和c-di-GMP系统中重要基因的鉴定和功能分析

论文摘要

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo）引起的白叶枯病是世界水稻生产上最严重的细菌病害之一。水稻—白叶枯病菌互作己成为植物—病原物互作机理研究的重要模式系统之一。长期以来,通过对Xoo致病功能基因的鉴定和分析,大大增加对其致病机理以及与水稻互作分子基础的认识。尤其是3个Xoo菌株全基因组测序的完成以及功能基因组学方法的应用,为开展Xoo致病功能基因的研究提供了坚实的基础。然而,由于病菌致病性/毒性并不只是由少数几个基因控制的,而是由复杂的细胞信号通讯（cell-cell communication）或群体感应（quorumsensing,简称QS）机制所调控的。对Xoo群体感应、信号系统以及关键基因的结构与功能、表达与调控的认识至今仍很有限。对Xoo群体感应信号系统调控网络的研究,有利于解析其致病性/毒性机理,为发展新型、有效和可持续的病害控制策略和方法提供科学依据。为了阐明Xoo在水稻侵染植株中是否存在群体感应现象,本研究利用以lipA和purH为靶基因序列的实时定量PCR（real-time PCR）方法,分析了Xoo在接种水稻植株内的种群量变化动态,建立了水稻白叶枯病分子定量“病菌靶基因拷贝数—DNA总量—种群量—植物病症”的研究模型,并在水稻细菌性条斑病中得到验证。Xoo接种3d后,水稻植株内己有菌量积累,但不显症;接种5d后,菌量显著增加,植株显症并逐渐加重;接种9-14d菌量增至峰值,并进入稳定平台期,植株显症严重。Xoo菌量至少要达到108-109CFU/克叶片组织才能成功引起寄主发病。推测Xoo可能利用细菌中普遍存在的群体感应机制调节对寄主水稻的侵染。为了鉴别Xoo群体感应信号途径,本研究首先使用信号报告菌株检测到Xoo存在与Xcc相同的群体感应可扩散信号因子（DSF）、而非高丝氨酸内酯类（AHL）信号。生物信息学分析表明,在Xoo基因组中存在与Xcc在结构上高度同源和保守的rpf基因簇,该基因簇与DSF信号生物合成和传导有关。用标记置换法,构建了与DSF信号系统有关的ΔrpfFxoo、ΔrpfCxoo和ΔrpfGxoo单基因缺失突变体以及ΔrpfFCxoo、ΔrpfFGxoo双基因缺失突变体。与野生型菌株PXO99A相比,ΔrpfFxoo、ΔrpfFCxoo和ΔrpfFGxoo均不产生DSF,而ΔrpfCxoo过量产生,ΔrpfGxoo产量减少。将rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo分别互补到甘蓝黑腐病菌XC1菌株的对应基因突变体中,可以恢复与野生型XC1相同的DSF产生表型。此外,尽管ΔrpfFxoo胞外多糖（EPS）产生无明显变化,而其它突变体EPS产生均显著减少;所有突变体胞外酶产生、HR和运动性均无明显改变;所有突变体对水稻的致病性均显著降低,在水稻叶片中的扩展长度和菌量显著下降,其中ΔrpfFCxoo和ΔrpfFGxoo致病性变弱更为明显。因此,rpfxoo基因在功能上起着与rpfxcc相似的作用,推测RpfFxoo与合成DSF信号有关,RpfCxoo和RpfGxoo组成双组分系统（TCS）,RpfCxoo感应环境中的DSF信号,RpfGxoo通过降解细胞环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）信号分子,从而调控下游基因的表达及其表型。c-di-GMP是一种由2个GTP组成的、新的细菌第二信使,可以调节运动性、生物膜形成和毒性因子合成等多种生物学表型。生物信息学分析表明,在Xoo基因组中大约有25个基因可能具有参与c-di-GMP代谢的功能。用标记置换法,分别构建推测具有c-di-GMP降解活性的磷酸二酯酶基因rsvRxoo（XOO2563）及其REC、GGDEF和EAL结构域缺失突变体。rsvRxoo缺失突变导致了EPS产生显著减少,对水稻的致病性下降,但是DSF信号产生、胞外降解酶和运动性无明显变化;3个结构域均与EPS产生有关,缺失其中任何一个结构域的突变体都不能正常产生EPS。表达rsvRxoo的E.coli菌株可以产生大量的DSF信号分子,这一过程需要GGDEF和EAL结构域的同时存在、而不需要REC结构域的存在。rsvRxoo基因可以互补ΔrpfCxoo和ΔrpfGxoo的EPS产生表型,但是rpfCxoo和rpfGxoo却不能互补ΔrsvRxoo的EPS产生表型。推测rsvRxoo可能与rpfC/rpfGxoo双组分系统属于两条途径来调控细菌EPS产生。此外,用标记置换法构建具有c-di-GMP合成活性的环化酶基因rsmRxoo缺失突变体。该基因突变可以引起细菌运动性下降,但是不影响鞭毛产生和对水稻的致病性,表达rsmRxoo的E.coli菌株同样产生大量的DSF信号物质。总之,本研究通过对Xoo在水稻侵染中的群体感应的鉴别,DSF信号分子检测,DSF和c-di-GMP信号途径中重要功能基因的分子克隆、缺失突变、互补以及生物学性状的测定,初步阐述和勾画了在Xoo群体感应系统中DSF—c-di-GMP—致病性/毒性表达的信号调控网络。一方面可以通过RpfC、RsvS等感应激酶接受胞外环境中或者来自于寄主的特异性刺激信号,另一方面又通过RpfG、RsvR和RsmR等反应调节子将刺激转化为胞内特殊信号如DSF和c-di-GMP,进而调控Xoo的毒性、EPS产生、运动性、胞外酶活性、生物膜形成等多种生物学表型的变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 细菌群体感应及其调节机制
• 1.1.1 革兰氏阴性菌中AHL信号介导的QS系统
• 1.1.2 革兰氏阴性菌中非AHL信号介导的OS系统
• 1.1.3 革兰氏阳性菌中寡肽信号介导的OS系统
• 1.1.4 革兰氏阳性菌中非寡肽信号介导的QS系统
• 1.1.5 AI-2信号介导的种间QS机制
• 1.2 Xcc中的群体感应和毒性调控机制
• 1.2.1 Xcc使用一种新型的OS信号
• 1.2.2 RpfC/RpfG双组分系统感应信号
• 1.2.3 第二信使c-di-GMP进一步传递信号
• 1.2.4 全局转录调节子Clp在OS中的调控作用
• 1.2.5 Xcc中复杂的信号调控网络
• 1.3 c-di-GMP在细菌致病性中的作用
• 1.3.1 c-di-GMP的合成和降解
• 1.3.2 调控c-di-GMP合成和降解的机制
• 1.3.3 c-di-GMP对致病性的调控机制
• 1.4 本研究的目的意义和技术路线
• 1.4.1 研究目的和意义
• 1.4.2 技术路线
• 第二章 Xoo在水稻植株内群体感应现象鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 生化试剂
• 2.1.3 培养基和菌株培养条件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻接种
• 2.2.2 Xoo和Xooc基因组DNA的制备
• 2.2.3 水稻叶片基因组DNA的制备
• 2.2.4 引物设计和筛选
• 2.2.5 常规PCR验证引物特异性
• 2.2.6 real-time PCR扩增反应体系
• 2.2.7 标准曲线的制作
• 2.2.8 病原菌的回收分离和计数
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 特异性引物筛选
• 2.3.2 Xoo Real-time PCR标准曲线的制作
• 2.3.3 Xoo接种水稻植株后的实时PCR定量分析
• 2.3.4 Xoo种群量变化及其与水稻显症之间的关系
• 2.3.5 Xooc real-time PCR标准曲线的制作
• 2.3.6 Xooc接种水稻植株后的实时PCR定量分析
• 2.3.7 Xooc种群量变化及其与水稻显症之间的关系
• 2.4 讨论
• 第三章 DSF系统中rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo基因功能分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 生化试剂
• 3.1.3 培养基和菌株培养条件
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 目的基因的扩增
• 3.2.2 目的基因片段纯化
• 3.2.3 目的基因片段的连接与转化
• 3.2.4 质粒DNA的提取
• 3.2.5 自杀载体的构建
• 3.2.6 用标记置换法构建突变体
• 3.2.7 构建突变体的互补菌株
• 3.2.8 ΔrpfFCxoo和ΔrpfFGxoo双基因突变菌株构建
• 3.2.9 基因序列的生物信息学分析
• 3.2.10 生长曲线测定
• 3.2.11 突变体运动性检测
• 3.2.12 突变体胞外酶活性的检测
• 3.2.13 胞外多糖分泌检测和菌落形态观察
• 3.2.14 DSF信号检测
• 3.2.15 生物被膜检测
• 3.2.16 突变体致病性和致敏性测定
• 3.2.17 Xoo总RNA提取
• 3.2.18 Xoo总RNA反转录
• 3.2.19 ΔrpfFxoo、ΔrpfCxoo、ΔrpfGxoo中部分基因的表达分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 rpf基因簇部分结构同源性分析
• 3.3.2 目的基因克隆
• 3.3.3 rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo基因的生物信息学分析
• 3.3.4 构建ΔrpfFxoo、ΔrpfCxoo、ΔrpfGxoo突变体菌株
• 3.3.5 ΔrpfFxoo、ΔrpfCxoo、ΔrpfGxoo互补分析
• 3.3.6 ΔrpfFCxoo和ΔrpfFGxoo双基因突变体构建
• 3.3.7 突变体生长曲线测定
• 3.3.8 突变体运动性分析
• 3.3.9 突变体胞外酶活性分析
• 3.3.10 突变体胞外多糖测定和菌落形态观察
• 3.3.11 突变体DSF信号的测定
• 3.3.12 突变体生物被膜的测定
• 3.3.13 突变体致病性和致敏性鉴定
• 3.3.14 ΔrpfFxoo、ΔrpfCxoo、ΔrpfGxoo中部分基因的表达分析
• 3.4 讨论
• 第四章 与c-di-GMP代谢相关的rsvRxoo和rsmRxoo基因的功能分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 生化试剂
• 4.1.3 培养基和菌株培养条件
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 基因序列的生物信息学分析
• 4.2.2 rsvRxoo和rsmRxoo基因突变体构建
• 4.2.3 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo互补菌株的构建
• 4.2.4 生长曲线测定
• 4.2.5 鞭毛运动性检测
• 4.2.6 突变体胞外酶活性的检测
• 4.2.7 胞外多糖分泌检测和形态观察
• 4.2.8 DSF信号检测
• 4.2.9 生物被膜的定性检测
• 4.2.10 突变体致病性测试和过敏性反应（HR）分析
• 4.2.11 real-time PCR定量分析部分基因表达变化
• 4.2.12 rsvRxoo结构域缺失互补分析
• 4.2.13 不同基因对突变体的互补作用
• 4.3 结果与分析
• A基因组中与c-di-GMP代谢相关基因的结构域分析'>4.3.1 PX099^A基因组中与c-di-GMP代谢相关基因的结构域分析
• 4.3.2 rsvRxoo和rsmRxoo生物信息学分析
• 4.3.3 构建ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo突变体菌株
• 4.3.4 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo的互补分析
• 4.3.5 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo生长曲线测定
• 4.3.6 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo运动性分析
• 4.3.7 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo胞外酶活性分析
• 4.3.8 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo突变体胞外多糖的测定
• 4.3.9 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo致病性和HR诱导能力测试
• 4.3.10 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo DSF的测定
• 4.3.11 ΔrsvRxoo和ΔrsmRxoo生物被膜的测定
• 4.3.12 rsvRxoo结构域缺失互补质粒构建
• 4.3.13 rsvRxoo结构域缺失互补菌株胞外多糖分泌和形态观察
• 4.3.14 rsvRxoo结构域缺失互补菌株DSF信号检测
• 4.2.15 ΔrsvRxoo中部分基因表达分析
• 4.3.16 不同基因间的反式互补作用
• 4.3.17 RsvRxoo可能与RsvSxoo组成双组分系统
• 4.4 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历