论文摘要
前言卵巢癌是女性生殖器官常见肿瘤之一，发病率虽低于宫颈癌和子宫内膜癌居第三位，死亡率却为妇科恶性肿瘤之首。主要原因之一是术后复发。70％患者在术后2年内复发，五年生存率仅为20～30％。肿瘤对化疗药物的敏感性及耐药性是决定术后复发的主要因素，并与患者的预后显著相关。所以明确耐药的原因将为卵巢癌化疗方案的选择提供理论依据，最终提高患者的五年生存率。我们在前期研究中发现卵巢癌细胞系RMG-I转染α1，2-岩藻糖转移酶基因后，细胞表面Lewis（y）抗原含量增加，细胞的恶性生物学行为增强，同时对化疗药5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的耐药性明显增强。细胞表面Lewis（y）抗原含量与卵巢癌细胞对铂类耐药性是否有关，国内外尚未见文献报道，而铂类是目前卵巢癌化疗中应用最多的药物。本次实验，我们以转染α1，2-岩藻糖转移酶基因后的Lewis（y）抗原稳定高表达卵巢癌细胞株RMG-I-H及其对照组RMG-I、RMG-I-C作为体外实验模型，研究细胞表面Lewis（y）抗原含量变化与细胞对卡铂耐药性的关系。材料与方法1、卵巢癌细胞株：RMG-I，RMG-I-C和RMG-I-H由中国医科大学附属盛京医院妇产科教研室林蓓教授提供。RMG-I-H和RMG-I-C分别为上皮性卵巢癌细胞株RMG-I稳定转染表达载体pcDNA3.1（-）-HFUT-H（含α1，2-岩藻糖转移酶基因）及空载体pcDNA3.1得到的细胞株。设RMG-I-H为实验组，RMG-I及RMG-I-C为对照组。2、四甲基偶氮唑盐（MTT）检测：取指数生长期细胞，常规培养24h。实验组加入工作浓度卡铂，同时设定阴性对照和空白对照。培养72h。于终止前4h，每孔加入20μl MTT（5mg/ml），继续培养。4h后弃上清，每孔加入150μl DMSO，水平震荡10min，于490nm波长处测各孔OD值。取30μg/ml，60μg/ml两个浓度，分别在24h、48h、72h、96h、120h5个时间点重复上述实验。计算各时点IR值。3、流式细胞仪（FCM）检测：取指数生长期细胞接种于25cm2的培养瓶中。实验组加入卡铂使其终浓度分别为30μg/ml，60μg/ml，另设阴性对照组，继续培养72h，收集细胞。按Annexin-V-FICT/PI试剂盒操作说明染色，利用流式细胞仪进行检测。4、荧光染色法观察观察细胞形态：取指数生长期细胞，接种于6孔板。实验组加入卡铂，使其终浓度分别为30μg/ml，60μg/ml，另设阴性对照组，继续培养72h，染色，荧光倒置显微镜（×400）观察并照相。结果1、MTT检测结果：三组细胞的IR有所不同，RMG-I-H的半数抑制浓度(half inhibitingconcentration，IC50)明显高于RMG-I和RMG-I-C的IC50（P均<0.001），而后两者间无统计学差异（P>0.05）。选择与IC50浓度相近的30μg/ml，60μg/ml两个浓度组检测不同时间点的IR，IR值随时间的变化趋势RMG-I-H与RMG-I和RMG-I-C均存在显著差异（P均<0.001），而后两组细胞间无统计学差异（P均>0.05）在半数抑制浓度范围内，各时间点细胞耐药性的差别只与细胞种类有关。2、细胞凋亡率的变化：应用流式细胞仪检测30μg/ml，60μg/ml卡铂作用下实验组细胞RMG-I-H的相对凋亡坏死率明显低于两组对照组（P均<0.05），两组对照组RMG-I-C及RMG-I间的相对凋亡坏死率无明显差别（P均>0.05）。3、凋亡细胞形态学观察结果：细胞未发生凋亡时，呈椭圆形或多角形单层片状生长，不着色。当发生凋亡时，细胞的细胞质浓缩，体积变小，膜着绿色，细胞核着红色，细胞骨架解体，可见细胞碎削，偶见凋亡小体。相同浓度组RMG-I和RMG-I-C的凋亡和（或）坏死的细胞所占比例高于RMG-I-H。结论本次实验结果表明Lewis（y）抗原含量增加可能是卵巢癌细胞对卡铂耐药性增强的主要原因。