植物内生菌生物活性物质的研究

论文摘要

植物内生菌作为一个多样性十分丰富的微生物类群，代谢产物非常丰富，包括杀虫、抗菌、抗肿瘤等活性物质，是人们寻找新型抗菌、抗肿瘤药物的重要资源。本论文利用上海来益生物药物研发中心的植物内生菌资源，通过各种模型的筛选，在获得活性菌株的基础上，对其中的三株进行了菌种鉴定，并对它们的次级代谢产物进行分离、纯化及活性研究。主要研究工作包括以下几个方面： 利用770株植物内生菌进行了发酵液的样品制各，获得了7040份样品，经14种不同模型筛选，共获得16份活性样品。对具有HIV-1整合酶抑制剂活性的菌株HCCB00167、HCCB00189及具有抗肿瘤活性的菌株HCCB00189、HCCB01546进行进一步的研究。 根据菌株的形态、培养特征及18S rDNA序列分析结果，活性菌株HCCB00167、HCCB00189及HCCB01546进行菌种鉴定，分别鉴定为蚀丝霉属、枝顶孢霉属、白壳菌属。 对活性菌株HCCB00167、HCCB00189及HCCB01546进行了代谢产物的研究。应用多种分离方法，从菌株HCCB00167的发酵液中分离出七个化合物：HCCB00167-1～7。鉴定了其中6个化合物，分别为：5，8-过氧麦角甾-6，22-二烯-3-醇；麦角甾醇；3，22，24-三羟基-齐果墩烷-12-烯；4’-羟基，7-甲氧基异黄酮；4’，5-二羟基，7-甲氧基异黄酮；4-丁基-2-吡啶羧酸。其中化合物HCCB00167-7为首次直接从微生物来源的代谢产物中获得。 从菌株HCCB00189的发酵液中分离出五个化合物：HCCB00189-1～5。分别鉴定为：4-甲基苯甲酸羧甲基酯；4-甲氧甲酰基苯甲酸；4-羟甲基苯甲酸；4’，7-二羟基异黄酮，即大豆甙元；4’，5，7-三羟基异黄酮，即染料木素。其中HCCB00189-1、2、3三个化合物为首次从微生物来源的代谢产物中分离得到。并对五个化合物进行抗肿瘤活性测试，结果显示：化合物HCCB00189-4与HCCB00189-5对A549和LoVo细胞有较明显的抗肿瘤活性。 从菌株HCCB01546的发酵液中分离出六个化合物：HCCB01546-A-F。运用现代波谱技术，鉴定了其中5个化合物，分别为：麦角甾醇、过氧化麦角甾醇、环氧化细胞松驰素H、细胞松驰素N和环氧化细胞松驰素J。其中HCCB01546-C、D、E三个化合物为首次从白壳菌属中分离得到的细胞松驰素类物质。通过体外抗肿瘤活性测试发现化合物HCCB01546-B、HCCB01546-C及HCCB01546-E对肿瘤细胞A549和（或）LoVo细胞有较明显的抑制作用。 MTT法考察了化合物HCCB01546-C对多种肿瘤细胞的抑制作用，发现其抗肿瘤活性呈明显的剂量效应和时间效应关系，而肝癌Hep-G2细胞对化合物HCCB01546-C有明显耐受。体内移植瘤实验结果表明，化合物HCCB01546-C对裸鼠移植瘤的生长有明显的抑制作用，且均有一定的量效关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写
• 第1章 绪论
• 1.1 植物内生菌的研究概况
• 1.1.1 植物内生菌的定义及内生真菌的生态类群
• 1.1.2 植物内生真菌的多样性
• 1.1.3 植物内生菌与宿主植物之间的关系及其相互间的关系
• 1.1.4 植物内生菌的作用
• 1.2 药用植物内生真菌资源的研究现状
• 1.2.1 红豆杉内生真菌的研究
• 1.2.2 长春花、桃儿七药用植物内生真菌的研究
• 1.2.3 其它药用植物内生真菌的研究
• 1.3 植物内生菌产生活性代谢产物的理论研究
• 1.3.1 生物间的“基因水平传递”及“内共生理论”
• 1.3.2 生物之间的相互作用和“协同进化”
• 1.4 植物内生真菌产生的活性代谢产物研究进展
• 1.4.1 抗肿瘤活性物质
• 1.4.2 抗菌类活性物质
• 1.4.3 杀虫类活性物质
• 1.4.4 植物生长调节物质
• 1.4.5 免疫抑制剂
• 1.4.6 抗氧化剂
• 1.4.7 降血糖活性物质
• 1.4.8 抗病毒类活性化合物
• 1.5 植物内生真菌在天然药物研究中存在的问题和发展前景
• 1.5.1 内生菌次生代谢产物多样性是天然药物研究的潜在资源
• 1.5.2 植物内生真菌在天然药物研究中存在的问题和发展前景
• 1.6 立题依据
• 1.7 拟采用的技术线路
• 第2章 植物内生菌活性菌株的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.1.4 主要实验仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 筛选样品的制备
• 2.2.2 活性菌株的筛选
• 2.3 结果
• 2.3.1 筛选样品制备结果
• 2.3.2 活性菌株筛选结果
• 2.4 小结与讨论
• 第3章 植物内生菌的代谢产物研究与菌种鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要培养基
• 3.1.3 主要实验仪器与设备
• 3.1.4 主要实验试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 种子、发酵培养
• 3.2.2 产物的分离纯化
• 3.2.3 化合物的活性测定
• 3.2.4 菌株鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 植物内生菌HCCB00167的代谢产物研究
• 3.3.2 植物内生菌HCCB00189的代谢产物研究
• 3.3.3 植物内生菌HCCB01546的代谢产物研究
• 3.3.4 活性菌株的鉴定
• 3.4 小结与讨论
• 第4章 化合物HCCB01546-C的抗肿瘤药效学研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 瘤源、细胞株及实验动物
• 4.1.2 受试样品
• 4.1.3 主要实验试剂
• 4.1.4 主要实验仪器与设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 肿瘤细胞的体外培养
• 4.2.2 化合物HCCB01546-C对肿瘤细胞的体外抑制实验
• 4.2.3 化合物HCCB01546-C对小鼠肝癌H22的体内生长抑制的研究
• 4.2.4 化合物HCCB01546-C对小鼠LEWIS肺癌生长抑制作用的研究
• 4.3 结果
• 4.3.1 化合物HCCB01546-C对多种肿瘤细胞的体外抑制活性
• 4.3.2 化合物HCCB01546-C对A549细胞体外抑制的时效关系
• 4.3.3 化合物HCCB01546-C对小鼠肝癌H22移植瘤体内生长的抑制作用
• 4.3.4 化合物HCCB01546-C对小鼠LEWIS肺癌生长的抑制作用
• 4.4 小结与讨论
• 第5章 化合物HCCB01546-C的抗肿瘤作用机制研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 细胞株
• 5.1.2 受试样品
• 5.1.3 主要实验试剂
• 5.1.4 主要实验仪器与设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 肿瘤细胞的体外培养
• 5.2.2 HCCB01546-C对肺癌A549体外增殖抑制作用的形态学观察
• 5.2.3 HCCB01546-C诱导肺癌细胞A549凋亡的能力及周期变化
• 5.2.4 HCCB01546-C对肺癌A549细胞一氧化氮（NO）的影响
• 5.2.5 HCCB01546-C对人乳腺癌血管内皮生长因子表达的影响
• 5.3 结果
• 5.3.1 化合物HCCB01546-C对肺癌A549细胞形态学上的变化
• 5.3.2 化合物HCCB01546-C诱导肿瘤细胞凋亡的能力
• 5.3.3 化合物HCCB01546-C对肿瘤细胞A549细胞周期的影响
• 5.3.4 细胞上清液中NO水平的变化
• 5.3.5 化合物HCCB01546-C对人乳腺癌血管内皮生长因子表达的影响
• 5.4 小结与讨论
• 全文总结
• 创新点及今后工作设想
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢
• 附录