鸡胚盘细胞培养及其转基因条件的研究

论文摘要

本实验以鸡X期胚盘细胞为研究对象,比较了整胚盘细胞培养与分散胚盘细胞培养两种形式下,细胞增殖及抑制分化的情况；摸索了胚盘细胞电穿孔法转染外源基因的条件；以转染了外源基因的胚盘细胞为供体细胞制作转基因嵌合体鸡,为转基因鸡的制作提供参考素材。研究结果如下：1.对鸡X期胚盘细胞分别进行整胚培养和分散培养,传代后的细胞进行碱性磷酸酶（AKP）染色鉴定并计算阳性克隆率,结果显示：分散细胞培养与整胚细胞培养传一代阳性克隆率分别为73.50%、57.65%,差异极显著（p<0.01）；传二代的阳性克隆率分别为66.70%、39.80%,差异极显著（p<0.01）。2.以EGFP为报告基因,电穿孔转染第2代鸡ES细胞,比较电压、脉冲时间、质粒浓度、电击前孵育温度、电击后孵育温度、细胞密度、细胞生长时期等因素对转染率的影响。结果显示：（1）当电压分别设置为180 V、230 V、280 V、330 V和380 V时,转染率分别为3.01%、5.81%、10.83%、6.70%和4.08%,转染率在280 V时最高,各组电压下的转染率均差异极显著（p<0.01）；（2）当脉冲时间分别为55μs、75μs、95μs和115μs时,转染率分别为10.83%、14.76%、5.69%和4.09%,转染率在75μs时最高,各组时间常数下的转染率均差异极显著（p<0.01）；（3）当质粒浓度分别为0μg·mL-1、10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1和25μg·mL-1时,转染率分别为0%、14.76%、15.91%、18.02%和12.34%,质粒浓度在0μg·mL-1～15μg·mL-1时,存活率差异不显著（p>0.05）,转染率随质粒浓度的增加成上升趋势,差异显著（p<0.05）；而在浓度为20μg·mL-1和25μg·mL-1时,存活率和转染率随着质粒浓度的增加呈下降趋势,两者存活率和转染率均差异极显著（p<0.01）；（4）当电击前孵育温度分别为4℃、25℃和37℃时,转染率分别为21.52%、18.02%和12.86%,置于4℃时的转染率最高。三个温度下静置10 min的细胞的存活率差异不显著（p>0.05）,但置于4℃的细胞与置于25℃（室温）及37℃的转染率差异极显著（p<0.01）；（5）电击后孵育温度为4℃、25℃和37℃时,转染率分别为21.52%、21.98%和9.80%,电击后将电极杯放置在4℃和25℃（室温）静置10 min的细胞的存活率和转染率均差异不显著（p>0.05）,而这两个温度下的细胞存活率和转染率与放置37℃时的差异极显著（p<0.01）；（6）当细胞密度为1×104个·mL-1、1×105个·mL-1、1×106个·mL-1和1×107个·mL-1时,转染率分别为1.89%、21.79%、21.98%和8.73%,细胞密度必须大于1×105个·mL-1才能有效的转染,细胞密度为1×105个·mL-1和1×106个·mL-1时细胞的存活率和转染率差异不显著（p>0.05）。3.制作鸡嵌合体模型前采用三种方法对种蛋开窗,换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗法,采用换壳法的孵化效率为0；采用钝端开窗法、赤道面开窗法孵化效率分别为25%、31.67%,差异极显著（p<0.01）。受体种蛋不同处理对孵化率的影响,结果显示：正常孵化组、开窗不注射组、开窗注射培养基组、开窗注射筛选好已转染的ES细胞组,孵化率分别为96.7%、35%、14.29%、5.21%,各组间均差异极显著（p<0.01）。收集到的死胚中有2只发生毛色嵌合,1只黑色绒羽位于背部,另1只黑色绒羽位于头部和尾部。孵化出壳的5只嵌合体鸡没有发生毛色嵌合。对5只存活的嵌合体鸡血液DNA进行PCR扩增检测,没有条带。对5只存活的嵌合体鸡解剖提取各种组织DNA进行PCR扩增检测,有4只嵌合体鸡的部分组织表达了EGFP基因。No.1号经人工助产出壳,21日龄时出现站立不稳、腿脚弯曲、食欲不正等症状,38 d时死亡,肝、腿肌、胸肌、心脏、腺胃、肾、性腺组织PCR扩增为阳性；No.2号鸡正常出壳,33日龄时出现和No.1号鸡相似的症状,站立不稳、食欲不正、精神萎靡,47 d时死亡,胸肌、腿肌、心脏、脑、肾组织PCR扩增为阳性；No.3号鸡正常出壳,23 d时死亡,未出现异常症状,解剖后各组织器官也未发生病变,肝脏、肺、胃组织PCR扩增为阳性；No.4号为母鸡,生长状况良好,88日龄时将其解剖后取提取各个组织DNA,PCR扩增全为阴性；No.5号为公鸡,生长状况良好,88日龄时将其解剖后提取各个组织DNA,肝脏、胸肌、胃、肾、性腺组织PCR扩增为阳性；阴性对照鸡各个组织DNA PCR扩增全为阴性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 一、鸡的生理生殖特点
• 二、胚胎干细胞的研究历史及现状
• 2.1 胚胎干细胞的分离和培养
• 2.2 鸡胚胎干细胞的离体培养体系
• 2.3 胚胎干细胞的鉴定
• 三、嵌合体鸡的制作
• 3.1 以X期胚盘细胞为供体的嵌合体鸡的制作
• 3.2 以原始生殖细胞为供体的嵌合体鸡的制作
• 3.3 鸡ES嵌合体的制作流程
• 四、嵌合体的应用
• 4.1 在保种上的应用
• 4.2 在转基因上的应用
• 五、本研究的目的和意义
• 第二章 鸡X期胚盘细胞分散培养与整胚培养比较初探
• 1. 材料和方法
• 1.1 种蛋
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 饲养层的制备
• 1.5 鸡X期胚盘细胞分离培养和传代
• 1.6 AKP活性鉴定
• 1.7 阳性克隆率的观察与计算
• 1.8 统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 鸡X期胚盘细胞分散培养观察
• 2.2 鸡X期胚盘细胞整胚培养观察
• 2.3 AKP活性检测
• 2.4 阳性克隆率
• 3 讨论
• 第三章 鸡X期胚盘细胞电转染外源基因条件的探索
• 1 材料和方法
• 1.1 主要仪器和设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 鸡X期胚盘细胞分离培养和传代
• 1.4 鸡X期胚盘细胞鉴定
• 1.5 pEGFP-N1质粒的制备
• 1.6 pEGFP-N1质粒电穿孔转染鸡X期胚盘细胞条件的优化
• 1.7 存活率的观察与计算
• 1.8 转染率的观察与计算
• 1.9 统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 鸡ES细胞的鉴定结果
• 2.2 pEGFP-N1质粒电穿孔转染鸡X期胚盘细胞条件的优化结果
• 3 讨论
• 第四章 携带EGFP基因的鸡X期胚盘细胞制作嵌合体鸡模型初探
• 1 材料和方法
• 1.1 种蛋
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 经筛选的转基因胚胎干细胞的制备
• 1.4 ES嵌合体的制备
• 1.5 嵌合体鸡的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 受体种蛋不同开窗方法比较细胞
• 2.2 显微注射不同处理方法结果
• 2.3 肉眼观察结果
• 2.4 DNA PCR检测
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文