水稻早衰控制基因的克隆及其功能研究&水稻出糙率的QTL定位研究

论文摘要

叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官,并最终与作物产量的形成密切相关。自上世纪七十年代以来,人们期望通过控制或延缓叶片的衰老以进一步提高作物的产量或调节作物的生长进程。本研究采用的突变体es-n是经EMS诱变处理日本晴后筛选获得的,es-n表型非常明显,新抽叶叶缘变黄,内卷,部分新叶呈螺旋状,老叶上有点状锈斑。同时,es-n发芽率低,但苗期的耐冷性相对于野生型更强。本研究对该突变体进行了等位性检测、叶片细胞形态学切片观察,突变性状遗传分析,早衰控制基因的图位克隆及功能初步研究,主要结果如下:1)成功分离出控制水稻早衰基因ES-n,遗传分析表明,该早衰性状是单隐性核基因控制的质量性状。2)细胞学观察和一些测定结果表明:突变体叶片表面较野生型光滑,突变体es-n叶绿体中类囊体排列紊乱,es-n的净光合效率、气孔导度、蒸腾速率都低于其野生型品种日本晴,而胞间CO2浓度则要高于对照品种,说明突变体叶绿素含量的降低影响了其光合速率。切片结果表明突变体es-n在叶片的微管系统发育出现异常,导致了水分运输或随同水分一起运输的矿质元素运输受阻。3)利用图位克隆法克隆出控制水稻早衰基因ES-n,早衰突变体es-n发生单碱基突变,突变事件发生在剪接位点上,由于剪接错误导致读码框移位,提前终止,造成基因功能的改变。通过互补验证,确定早衰突变表型由此基因突变造成。同时,还发现另外两个早衰突变体与es-n等位,突变位点也是单碱基替换,替换发生在编码区,导致氨基酸的变化。4)es-n编码一个结合蛋白,ES-n在各个器官中都有表达,表达量差别不是很大,只是在根部和叶片的位置表达量稍有降低。5)芯片结果分析发现,早衰性状与水稻生理节律、溴苯合成基因、苯基丙氨酸代谢基因、赖氨酸生化合成等基因相关水稻是人类的主食,随着人口的持续增长和耕地面积的锐减,粮食安全已成为全球性的问题。所以,保证粮食安全迫在眉睫,追求高产也是水稻生产中一个非常重要的课题,目前已有许多关于产量的QTL被克隆出来,糙米率也能直接影响水稻实际产量。过去十几年中,也有相关的报道,但取得实际应用价值的并不多。本研究利用一套DH群体图谱检测糙米率及其它一些外观品质性状,DH群体由典型的籼稻品种台中本地1号（TN1）和典型的粳稻品种春江06（CJ06）杂交的F1花药加倍而来。通过遗传连锁图谱,一共检测到四个控制糙米率的QTLs,分别位于1、8、9和10染色体上。同时,另外三个外观品质性状的QTLs也被检测出来,两个粒重的,一个粒型长宽比的,分别位于6、9和10染色体上。通过图位克隆的方法,q-BRR10被最终定位在149K的物理范围内,为了进一步的克隆该基因,建立了在这几个区间内的染色体单片段置换系。切片结果显示,水稻颖壳的细胞层数可能是影响糙米率的一个关键因素。本文检测的BRR、qGL/W-6、GW9和GW10这些QTLs对水稻的产量和外观品质都有重要的意义,如果将与这些QTL紧密连锁的标记开发出来并用之于育种当中将是非常有用的。同时,本文对水稻籽粒的发育研究也能提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 水稻突变体库的创建及功能基因的克隆方法
• 1.2.1 水稻突变体库的创建
• 1.2.2 水稻基因克隆的方法
• 1.3 水稻QTL 定位的原理、方法及研究进展
• 1.3.1 水稻DNA 分子标记连锁图的构建
• 1.3.2 构建QTL 定位群体
• 1.3.3 从QTL 到基因
• 第二章 水稻早衰的研究进展
• 2.1 植物衰老概述
• 2.2 影响植物衰老的因素
• 2.2.1 库/源关系的变化影响植物衰老
• 2.2.2 激素影响植物衰老
• 2.2.3 自由基和矿质养分影响植物衰老
• 2.2.4 环境因素
• 2.3 植物叶片衰老机制
• 2.4 植物衰老的几种假说
• 2.5 植物衰老的相关基因
• 2.6 植物衰老研究的展望
• 第三章 水稻出糙率的研究进展及意义
• 3.1 水稻出糙率与产量
• 3.2 水稻籽粒的生物构成
• 3.3 谷壳的生长发育及其对产量的影响
• 3.4 谷壳生长发育的影响因素
• 3.5 谷壳的发育与粒重
• 3.6 糙米率的遗传研究进展
• 第四章 本研究的目的意义
• 4.1 水稻早衰突变体研究的意义
• 4.2 水稻出糙率研究的意义
• 第二部分 研究报告
• 第一章 水稻早衰控制基因的克隆及功能研究
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 早衰突变体的创制
• 1.1.2 水稻早衰突变体定位群体的配制
• 1.1.3 分子生物学试剂及仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 化学诱变
• 1.2.2 SPAD 值
• 1.2.3 叶绿素含量测定
• 1.2.4 净光合速率的测定
• 1.2.5 叶绿体发育的透射电镜观察
• 1.2.6 扫描电镜样品制备方法
• 1.2.7 石腊切片观察
• 1.2.8 水培相关实验
• 1.2.9 耐冷处理
• 1.2.10 DNA 的提取及PCR 反应
• 1.2.11 电泳检测
• 1.2.12 发展标记精细定位ES-n 基因
• 1.2.13 大肠杆菌质粒DNA 的提取
• 1.2.14 总RNA 的提取及cDNA 的反转录
• 1.2.15 激素处理
• 1.2.16 载体构建
• 1.2.17 农杆菌介导法转化水稻
• 1.2.18 转基因苗的检测
• 1.2.19 突变体基因ES-n 的基因表达分析
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 早衰突变体的表型特征
• 1.3.2 es-n 的等位性检测
• 1.3.3 es-n 的根部吸水能力增强
• 1.3.4 es-n 的吐水能力下降
• 1.3.5 叶绿素含量及光合速率的测定
• 1.3.6 es-n 叶片表面较野生型光滑
• 1.3.7 es-n 叶绿体中类囊体排列紊乱
• 1.3.8 es-n 维管束发育异常
• 1.3.9 es-n 的金属离子含量升高
• 1.3.10 es-n 受单隐性核基因控制
• 1.3.11 ES-n 基因的图位克隆
• 1.3.12 ES-n 基因的反转录
• 1.3.13 es-n 对GA 和BR 等激素敏感
• 1.3.14 ES-n 的芯片分析
• 1.3.15 ES-n 的表达分析
• 1.3.16 ES-n 的转化情况
• 1.4 讨论
• 第二章 水稻出糙率的QTL 定位研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料及处理方法
• 2.1.2 单片段置换系的构建
• 2.1.3 水稻DNA 的提取及PCR 反应
• 2.1.4 分子标记的开发
• 2.1.5 糙米率性状及其相关的外观品质的调查
• 2.1.6 分子连锁图谱的构建和QTL 定位
• 2.1.7 石蜡切片与电镜观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 DH 群体及双亲各性状的表现
• 2.2.2 籽粒性状之间的相关性考察
• 2.2.3 QTL 定位分析
• 2.2.4 糙米率QTL qBRR-10 的片段置换
• 2.2.5 糙米率QTL qBRR-10 的精细定位
• 2.2.6 双亲的细胞学观察
• 2.3 讨论与展望
• 2.3.1 糙米率与水稻粒重
• 2.3.2 进一步的工作计划
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历