猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

论文摘要

本研究旨在建立快速,简便地检测猪传染性胃肠炎病毒的胶体金免疫层析方法。利用辛酸-饱和硫酸铵法和亲和层析柱联合法纯化兔抗TGEV N蛋白的多克隆抗体及抗TGEV N蛋白的单克隆抗体。纯化后的多抗浓度为1.692mg/ml,经SDS-PAGE电泳分析IgG重链和轻链区带明显,纯度为100%。血清抗体效价由2.56×105下降为6.4×104。纯化后的单抗浓度为1.933mg/ml,经SDS-PAGE电泳分析IgG重链和轻链区带明显,纯度为100%。腹水抗体效价由6.4×104下降为1.6×104。纯化后的多抗和单抗可分别用于检测和标记。采用柠檬酸三钠法制备20nm胶体金,通过肉眼观察,可见金溶液为酒红色,透明均匀。通过电镜扫描观察到,金颗粒分布均匀,大小均一。紫外扫描观察到最大吸收峰波长为520nm,峰宽较小,说明胶体金颗粒分布比较均匀。实验结果表明所制备的金颗粒可以用于标记单抗。用所制的金颗粒标记单克隆抗体,通过实验确定了稳定1 ml胶体金所需的最小蛋白用量为0.2mg,最适pH值为7.6。将金标抗体喷涂在玻璃纤维膜上,在试纸条连接的硝酸纤维素膜上固定有抗TGEV N蛋白的多克隆抗体作为检测线,羊抗鼠IgG的抗体作为质控线,在膜的另一端为吸收样品的吸水纸垫。当被检测样品加入样品垫后,液体便流向免疫胶体金结合垫,然后流向硝酸纤维素膜并最终流向吸水纸垫。如果样品中含有猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）,膜上便会出现肉眼可见的红色检测线,如果样品中无猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）,则不会在膜上显示可见的红色线检测线。本研究对猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行优化,选择了效果较好的多抗包被液（0.01M pH 7.4 PBS）,封闭液（0.01M pH 7.4 PBS含2% BSA）,金标稀释液（0.01M pH 7.4 PBS含0.1 % BSA,0.5%蔗糖）,硝酸纤维素膜（HF135）,玻璃纤维膜（PR-NJ25）,样品垫（PR-VL78）和吸收垫（CH-270K）。确定了最佳的封闭条件为室温封闭10min。并确定了NC膜上多抗的包被浓度为0.0169mg/ml,玻璃纤维膜上金标抗体的喷涂量为0.037mg/ml。本研究探索了胶体金免疫层析检测猪传染性胃肠炎病毒的方法,使用试纸条对TCID50为10-5.8的病毒培养液进行检测,检测限为100TCID50。经测试,试纸条与猪流行性腹泻病毒,轮状病毒和猪细小病毒无交叉反应,重复性较好,4℃条件下密封保存90天后仍能有效检测样品。此方法最大的优点是无需借助检测仪器,检测所需试剂都已事先包被在试纸条上,检测快速,简便,5min内可以得出检测结果。适用于对猪传染性胃肠炎病毒的现场快速检测。本研究也可为其他病毒检测试纸条的研制提供借鉴.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 TGEV 病原学特性及研究进展
• 1.1.1 TGEV 形态学特征
• 1.1.2 TGEV 培养特性
• 1.1.3 TGEV 理化特性
• 1.1.4 TGEV 分子生物学研究进展
• 1.2 TGEV 流行病学
• 1.3 TGEV 的诊断
• 1.3.1 传统的诊断方法
• 1.3.2 分子生物学诊断方法
• 1.4 免疫胶体金标记技术的研究进展
• 1.4.1 免疫胶体金标记技术
• 1.4.2 免疫胶体金标记技术的应用
• 1.5 本实验研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞与病毒
• 2.1.2 菌株和检测样品
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 TGEV N 蛋白的诱导表达与纯化
• 2.2.2 兔抗TGEV N 蛋白血清制备及其抗体（IgG）的提纯
• 2.2.3 腹水抗体的制备与纯化
• 2.2.4 免疫胶体金颗粒的制备
• 2.2.5 免疫胶体金试纸条的制备
• 2.2.6 免疫胶体金试纸条的组装和测试
• 3 结果
• 3.1 TGEV N 蛋白的诱导表达与纯化
• 3.1.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 3.1.2 蛋白浓度检测
• 3.2 兔抗TGEV N 蛋白血清制备及其抗体（IgG）的提纯
• 3.2.1 纯化前后兔抗TGEV N 蛋白多抗效价的测定
• 3.2.2 纯化前后兔抗TGEV N 蛋白多抗纯度的鉴定
• 3.2.3 纯化后兔抗TGEV N 蛋白多抗浓度的测定
• 3.3 腹水抗体的制备与纯化
• 3.3.1 纯化前后腹水抗体效价的测定
• 3.3.2 纯化前后腹水抗体纯度的鉴定
• 3.3.3 纯化后腹水抗体蛋白浓度的测定
• 3.4 胶体金质量的鉴定
• 3.5 免疫胶体金试纸条的制备
• 3.5.1 稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择
• 3.5.2 胶体金标记抗体的鉴定
• 3.5.3 试纸条反应条件的优化
• 3.6 免疫胶体金试纸条的测试
• 3.6.1 灵敏性
• 3.6.2 特异性
• 3.6.3 重复性
• 3.6.4 稳定性
• 4 讨论
• 4.1 抗体IgG 的纯化
• 4.2 影响胶体金颗粒和胶体金标记抗体制备的几个因素
• 4.3 金标抗体喷涂量的确定
• 4.4 T 线及C 线的优化
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文