论文摘要
淀粉和糖原是发酵工业中最常用的有机物质资源,目前对淀粉和糖原降解利用多数是通过化学的方法,但化学方法成本较高,而利用微生物有更多的优点,例如环保、成本低。微生物发酵多数是高温在下进行的,但能在高温下把淀粉和糖原降解的耐高温α-淀粉酶产生菌种类较少,因此对耐高温α-淀粉酶产生菌的筛选及人工改造是未来淀粉利用的重要途径。本研究通过对多种不同的土壤进行高温淀粉酶菌株筛选和鉴定,利用离子束对筛选菌株进行诱变选育高酶活的突变菌株,并对突变菌的发酵条件和分子变异进行了初步研究,主要结果如下:1.从安徽具有典型高温环境地区的近100份土样中筛选分离到11株产高温淀粉酶的菌株,对其中一株酶活较高的菌株RL,经形态观察、16SrDNA测序分析,证实该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。2.利用Ar+N+两种低能离子注入RL进行诱变,研究存活率和突变率,在相同的能量和剂量下,Ar+诱变存活率低于N+,但是N+注入的平均突变率明显高于Ar+。经过对诱变条件系统地研究,得到出发菌株最适的注入离子为N+,适宜的注入能量为10keV、注入剂量为2.08×1015ions/cm2。3.经过两轮诱变和筛选,得到了1株高产高温淀粉酶突变菌株RL-1,经传代实验表明该菌株在降解淀粉的遗传性状上表现稳定,测定突变株RL-1酶活提高了57.1%。4.对RL-1菌株耐高温淀粉酶进行酶学性质分析,结果显示该酶的最适反应温度为75℃,属高温淀粉酶,最适反应pH为6.5,60℃以上保温80 min仍可保持80%左右的酶活力,而温度低于20℃酶活迅速下降。在pH4～9的范围内,具有比较良好的pH稳定性。Ca2+对酶有激活作用,Cu2+、Mg2+、Mn2+对酶活具有不同程度的抑制作用。5.利用PCR技术,对原始菌株和突变菌株的高温淀粉酶基因进行序列测定,发现高产菌株高温淀粉酶基因序列发生了4个碱基的变化,并导致氨基酸序列的部分改变,这为进一步研究耐高温淀粉酶产生菌突变的分子机制提供了一定的依据。
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摘要Abstract目录插图与附表清单1 文献综述1.1 淀粉酶概述1.1.1 耐高温a-淀粉酶介绍1.1.2 耐高温a-淀粉酶的应用1.1.3 耐高温a-淀粉酶的开发趋势1.1.4 耐高温a-淀粉酶的研究进展1.1.5 耐高温a-淀粉酶的生产2.1 离子束生物工程学研究进展2.1.1 低能离子注入技术概述2.1.2 低能离子注入的生物效应2.1.3 离子束生物工程学的应用2.1.4 离子束介导转基因研究进展2.引言2.1 国内外耐高温a-淀粉酶的研究进展2.2 本研究的内容和目标2.2.1 本研究的内容2.2.2 本研究的目标2.3 本研究的技术路线3、材料与方法3.1 材料3.1.1 土样及菌株3.1.2 培养基3.1.3 主要仪器设备和试剂3.2 方法3.2.1 耐高温淀粉菌株筛选的方法3.2.2 菌种鉴定3.2.3 采用分光光度计法测定酶活3.2.4 菌种保藏3.2.5 低能离子注入诱变选育的方法3.2.6 发酵工艺的研究3.2.7 酶学性质的研究3.2.8 淀粉酶基因序列的测定4、结果与分析4.1.产高温淀粉酶菌株的筛选4.2 RL常规形态鉴定4.3 分子鉴定4.4 进化树的构建4.5 LR菌的诱变选育+、Ar+离子注入其存活率与注入剂量间的关系'>4.5.1 N+、Ar+离子注入其存活率与注入剂量间的关系4.5.2 突变率与注入剂量间的关系4.5.3 菌株的分离与筛选4.6 遗传稳定性的传代实验4.7 发酵工艺的研究4.7.1 研究LR-1菌株的生长曲线4.7.2 pH对菌株生长和相对酶活的影响4.7.3 温度对菌株生长和相对酶活的影响4.7.4 培养基的优化4.8 酶学性质研究4.8.1 胞外酶的鉴定4.8.2 酶反应的最适pH4.8.3 酶反应的最适温度4.8.4 金属离子对淀粉酶活性的影响4.8.5 酶的PH稳定4.8.6 酶的热稳定4.9 LR菌株酶活提高的分子机制研究4.9.1 高温淀粉酶基因的PCR4.9.2 序列测定后的碱基序列比较4.9.3 氨基酸序列分析5 讨论5.1.产耐高温淀粉酶菌株筛选模型的建立5.2 分子鉴定与进化树的构建5.3 低能离子注入的生物学效应5.4 耐高温淀粉酶酶活力的提高6.结论参考文献附录致谢作者简介攻读硕士研究生期间论文发表情况
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