论文摘要
目的: 本实验通过对SiHa细胞的体外传代培养,观察不同浓度清疣Ⅱ号洗剂对SiHa细胞中HPV E7和PCNA蛋白表达的影响,研究其抑制HPV感染细胞增殖,防治尖锐湿疣,减少复发的药理作用机制。 方法: 1.细胞培养:应用体外细胞培养技术,使用10%RPMI 1640培养基,在37℃、5%CO2条件下进行SiHa细胞的传代培养。 2.药物制备:中药原药经水煮醇沉,浓缩至1g/ml（每毫升药汁含生药1克）,过滤,除菌,分装,4℃冰箱保存备用。 3.实验分组:①空白组,即SiHa细胞组;②不同浓度清疣Ⅱ号洗剂组:10-3g/ml组,10-4/ml组,10-5g/ml组,10-6g/ml组。 4.指标检测:①待传代细胞充分贴壁后加入不同浓度中药清疣Ⅱ号洗剂,并于48h内观察细胞生长形态的变化。②采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法,将对数生长期细胞消化成单细胞悬液后接种于96孔板,按上述分组加入受试品,培养48h后酶标仪检测每孔OD490值,观察加药后各组SiHa细胞的增殖抑制水平。③将已消化成单细胞悬液的细胞接种到盖玻片上,待其完全贴壁生长后,按上述分组加入受试品,培养48h后制成细胞铺片。采用间接免疫荧光技术,观察各组细胞铺片中HPV E7和PCNA蛋白荧光表达情况。 4.所有实验数据均用均数±标准差（（?）±S）表示,采用单因素方差分析、t检验、相关分析和回归分析,所有数据经SPSS11.5 for windows软件进行统计处理。 结果: 1.细胞形态观察:传代培养的SiHa细胞,生长良好,胞浆饱满,大小均匀,细胞呈梭型、纺锤型、三角形,中央可见卵圆型核,纯度极高。经中药清疣Ⅱ号洗剂处理后SiHa细胞亦贴壁良好,生长舒展,细胞折光性可。 2.抑制细胞增殖:各实验组分别作用SiHa细胞48h后,空白组OD490值为0.8450+0.0271,10-6g/ml组至10-3g/ml组的OD490值依次为0.7351±0.0428,0.5963±0.0514,0.5103±0.0455,0.3810±0.1704;随药物浓度梯度的升高,各加药组细胞增殖活性逐渐降低,与空白组比较有显著性差异（P<0.01）;各加药组组间比较亦有显著性差异（P<0.01）。各加药组分别作用SiHa细胞48h后,随药物浓度梯度的升高,增殖抑制率亦逐渐增高,依次为（12.9860±4.7639）%,（29.4780±4.8062）%,（39.6520±4.1867）%和（54.9140±2.4769）%,与空白组比较有显著性差异（P<0.01）;增殖抑制率各加药组组间比较亦有显著性差异（P<0.01）;经相关分析显示,增殖抑制率与药物浓度之间呈高度正相关,r=0.994,P<0.01。提示以上各清疣Ⅱ号洗剂组对SiHa细胞的增殖有明显抑制作用,且具有浓度效应关系。 3.抑制HPV E7和PCNA蛋白表达:经中药清疣Ⅱ号洗剂处理后,强表达HPVE7和PCNA荧光的阳性细胞数减少,弱表达HPV E7和PCNA荧光的阴性细胞数增加。HPV E7和PCNA蛋白表达的平均荧光灰度随药物浓度梯度的升高逐渐增高,阳性单位随药物浓度梯度的升高逐渐减小。10-6ml组PCNA蛋白荧光的平均灰度与空白组比较无显著性差异（P>0.05）,10-5g/ml组、10-4g/ml组和10-3g/ml组PCNA蛋白荧光的平均灰度与空白组比较均有显著性差异（P<0.01）;各加药组SiHa细胞PCNA湖北中医学院硕七研究生毕业论文蛋白荧光的阳性单位与空白组比较均有显著性差异（P<0 .01）;各加药组HPv E7蛋白荧光的平均灰度和阳性单位与空白组比较均有显著性差异（P<0.01）。提示不同浓度清疵11号洗剂均可明显抑制SIHa细胞HPV E7和PCNA蛋白的表达。结论: 本实验研究表明:清疵11号洗剂能够有效下调HPV E7和PCNA蛋白的表达,从而抑制体外培养的SIHa细胞增殖。这可能是其临床治疗尖锐湿洗的药理作用机制之一。主题词: 尖锐湿疵;HPV;siHa细胞;蛋白表达;人;实验研究;@清疵11号洗剂
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