猪场土壤中猪细小病毒和链球菌的检测与消毒剂的筛选

论文摘要

随着我国畜牧养殖业尤其是集约化养殖的发展,养殖场周围的土壤环境污染问题越来越受到大家的关注。为此本研究选取猪细小病毒和猪链球菌病原菌为代表,首先建立了检测土壤中两种病原菌的方法并利用建立的检测方法对猪场土壤中的污染情况进行了调查,然后对相关的消毒剂进行了筛选,以有效控制猪场土壤环境中病原菌的污染。（1）猪场土壤中猪细小病毒检测方法的建立及应用选择猪细小病毒VP2基因为靶目标,用环介导恒温扩增（LAMP）引物设计专用软件,设计4条识别目的片段6个特异性位点的引物。对土壤中常见的病原菌进行LAMP扩增反应,未发现非特异性扩增反应,说明其具有较好的特异性。敏感性试验结果表明其检测灵敏度为0.002个TCID50,比PCR高10倍。用该方法对采白湖北18个猪场的92份样品进行了检测,LAMP和PCR分别检出14份和10份阳性,检测结果表明所建立的LAMP是一种特异性高、敏感性强而又快速简便的检测方法。（2）猪场土壤中猪链球菌的检测方法的建立及应用选择猪链球菌GDH基因为靶目标,建立了土壤中猪链球菌的PCR检测方法。利用该方法对猪场土壤中猪链球菌的感染情况进行了检测,结果在采自18个猪场的92份样品中检出阳性21份,阳性率为22.83%。同时对土壤中猪链球菌的培养基进行了筛选。以各抗菌药物对猪链球菌的MIC90和抗菌谱差异,最终选定多粘菌素B、四环素、磺胺间甲氧嘧啶作为猪链球菌的抗菌添加剂,其浓度分别为30μg/mL、15μg/mL、15μg/mL,生长率为94.1%,可以用于土壤中猪链球菌的分离和检测。（3）消毒剂对猪场土壤中猪链球菌的杀灭作用本研究选取依绿笑、戊二醛、安必杀、天然净四种消毒剂对土壤中猪链球菌进行消毒评价。稀释液试验结果表明：0.1%Tween 80/PBS分散性最好。中和剂试验结果表明：安比杀选用0.5% Na28203+1%卵磷脂+1％Tween80/PBS;依绿笑选用0.5%Na2S2O3+1%Tween80/PBS；戊二醛选用1%甘氨酸+1%卵磷脂+1%Tween80/PBS。土壤载体试验结果表明：100mg/L二氧化氯的依绿笑溶液作用1h或0.1%戊二醛溶液作用10min对猪链球菌的杀灭率达100.0%,安必杀只能在2000mg/L高浓度作用30min下才能杀灭猪链球菌,天然净对猪链球菌基本上没有杀灭作用。田间试验结果表明：选用600mg/L二氧化氯的依绿笑溶液和0.1%戊二醛溶液分别在24h和48h对土壤中的猪链球菌的杀灭率达100.0%,可有效的控制土壤环境中猪链球菌的污染。本研究建立了土壤中猪细小病毒和猪链球菌的检测方法为以后预防疾病的发生以及控制提供理论依据,同时筛选出有效针对猪场附近土壤中猪链球菌消毒剂,进行土壤污染治理,防止病原菌的进一步扩散。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪细小病毒的概述
• 1.1.1 猪细小病毒病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 猪细小病毒病的检测方法
• 1.2 猪链球菌的概述
• 1.2.1 流行病学
• 1.2.2 猪链球菌的检测方法
• 1.3 消毒与消毒剂
• 1.3.1 常用消毒方法分类
• 1.3.2 影响消毒效果的因素
• 1.3.3 理想消毒剂的条件
• 第二章 研究的目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 第四章 结果和分析
• 4.1 土壤中猪细小病毒诊断方法的建立
• 4.1.1 土壤中猪细小病毒LAMP扩增诊断方法的建立
• 4.1.2 LAMP方法的特异性
• 4.1.3 LAMP方法的敏感性
• 4.1.4 LAMP产物的检测方法
• 4.1.5 土壤中猪细小病毒PCR检测方法的建立
• 4.1.6 LAMP方法的临床应用
• 4.2 土壤中猪链球菌检测方法的建立
• 4.2.1 猪链球菌PCR检测方法建立
• 4.2.2 PCR反应中添加BSA条件优化
• 4.2.3 PCR方法的特异性
• 4.2.4 PCR方法临床应用
• 4.2.5 猪链球菌选择性培养基的筛选
• 4.3 消毒剂对土壤中猪链球菌杀菌效果
• 4.3.1 稀释液筛选试验
• 4.3.2 中和剂筛选试验
• 4.3.3 土壤载体试验
• 4.3.4 田间试验
• 第五章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 土壤中猪细小病毒检测方法的建立及应用
• 5.1.2 土壤中猪链球菌检测方法的建立及应用
• 5.1.3 消毒剂对土壤中猪链球菌杀菌效果的比较研究
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢