PGA固定化及其基因的真核表达研究

论文摘要

青霉素G酰化酶（penicillin G acylase，EC 3.5.1.11，简称PGA）可以催化青霉素G水解生成6-氨基青霉素烷酸（6-APA），6-APA是生产半合成青霉素的重要中间体。因此，PGA具有重要的工业价值。本文根据GenBank中已有的巨大芽孢杆菌PGA基因序列设计了上下游引物，通过PCR扩增出巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）1.1741中PGA基因。将所得的PGA基因克隆至T71ac启动子控制下的表达载体pYES2（amp+，ura+）中，构建了表达质粒pYES2-PGA，并转化进酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H158中表达，得到4株重组菌株Y1、Y2、Y3、Y4。在不需要苯乙酸诱导的发酵培养中，均在培养液中测到了青霉素酰化酶活性，其中Y4的酶活最高，达到0.75 U／ml。如果再进行发酵培养等优化，还有提高酶活量的潜力。将pYES2-PGA进行测序，并将测序结果与GenBank中已有其它三株巨大芽孢杆菌的PGA基因序列比对，表现出很高的同源性，分别达到97.1％、99.8％和99.8％。固定青霉素酰化酶在工业生产半合成抗生素中具有重要作用，本实验还采用包埋法将无机磁性粒子Fe3O4与有机材料海藻酸钠结合起来形成的一种复合磁性微胶囊，表面含有特征性功能基团。从而有效提高固定化青霉素酰化酶的稳定性和回收率。通过对青霉素酰化酶的固定化研究，优化了固定化参数：给酶量为333.3 U／g（干载体），反应时间为4h，pH为7.5，反应温度37℃。在此条件下固定化酶活性为173.6 u／g（干载体），固定化效率为74.95％，活性回收率为52.08％，水解反应的最适pH为7.5，最适温度为40℃，且固定化酶的储存和多次实验操作稳定性良好。除此之外，测定了酶促反应的动力学常数：溶液酶和固定化酶的米氏常数分别为0.245 mol／l和0.421 mol／l。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 青霉素酰化酶概述
• 1.1.1 青霉素酰化酶的基因结构和表达调控
• 1.1.2 青霉素酰化酶的结构
• 1.1.3 青霉素酰化酶的作用原理及水解催化机制
• 1.1.4 青霉素酸化酶的应用
• 1.1.5 青霉素酰化酶产生菌菌种的改良
• 1.2 酿酒酵母表达系统
• 1.2.1 酿酒酵母的发展及遗传特性
• 1.2.2 酿酒酵母表达系统的应用及前景
• 1.2.3 pYES2载体
• 1.3 固定化酶研究概述
• 1.3.1 磁性材料的研究现状
• 1.3.2 制备磁性高分子聚合物
• 1.3.3 固定化酶技术的研究现状
• 1.3.4 青霉素酰化酶固定化技术研究现状
• 1.3.5 青霉素酰化酶的固定化方法
• 1.3.6 固定化酶的材料
• 1.4 本研究目的和意义
• 2 PGA基因在酿酒酵母中的表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抗生素
• 2.1.4 主要用酶
• 2.1.5 Marker
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 主要药品及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 巨大芽孢杆菌生长浓度的测定
• 2.2.2 基因组DNA的提取
• 2.2.3 核酸浓度及核酸纯度测定
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.5 PCR扩增PGA目的片断
• 2.2.6 目的片段回收（DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒）
• 2.2.7 质粒的提取
• 2.2.8 质粒载体和目的片断的制备
• 2.2.9 PGA基因与载体pYES2的连接
• 2.2.10 E.coli DH5a感受态细胞的制备及连接产物的转化
• 2.2.11 重组质粒的提取及酶切鉴定
• 2.2.12 酵母感受态细胞的制备及重组质粒的转化
• 2.2.13 酵母转化子的鉴定
• 2.2.14 重组质粒在酿酒酵母H158中的诱导表达
• 2.2.15 青霉素酰化酶活性测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 巨大芽孢杆菌1.1741生长浓度的生物量
• 2.3.2 基因组DNA提取
• 2.3.3 核酸浓度和纯度测定
• 2.3.4 PCR产物及胶回收后PGA目的片断检测
• 2.3.5 重组质粒pYES2-PGA的酶切及PCR鉴定
• 2.3.6 重组子诱导表达
• 3 PGA的固定化研究
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 磁性微胶囊的制备
• 3.2.2 磁性微胶囊官能团活化
• 3.2.3 青霉素酰化酶固定化
• 3.2.4 固定化条件筛选
• 3.2.5 游离与固定化青霉素酰化酶的酶学性质
• 3.2.6 米氏常数
• 3.2.7 SEM照片
• 3.2.8 活力回收和相对活力计算公式
• 3.3 结果与分析
• 3O₄纳米粒子的光学图片与磁性微胶囊晶体冻干后的SEM照片以及结构模型'>3.3.1 Fe₃O₄纳米粒子的光学图片与磁性微胶囊晶体冻干后的SEM照片以及结构模型
• 3.3.2 固定化条件筛选结果
• 3.3.3 游离与固定化青霉素酰化酶的酶学性质
• 3.3.4 游离与固定青霉素酰化酶动力学分析
• 3.3.5 活力回收和相对活力
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢