肠道病毒71型的层析纯化

论文摘要

手足口病是儿童流行疾病中比较常见的疾病之一,许多种肠道病毒都可以引起手足口病,近几年来在我国以肠道病毒71型(EV71)为主要的病原体。自1997年以来,EV71病毒的流行在亚太地区呈现上升的趋势,甚至引起了严重的中枢神经系统的感染或死亡,引起了人们的密切关注。由于目前还没有针对EV71病毒的特效药和疫苗,因此,研发一种能有效控制EV71病毒流行的疫苗已经势在必行。本研究的目的是为建立纯化EV71病毒工艺,为以后制备EV71病毒的疫苗提供可靠的研究数据。本研究以EV71病毒粗提液做为研究的材料,建立了凝胶过滤层析和离子交换层析相结合的纯化工艺,为EV71病毒纯度的提高提供了最佳的层析参数。首先,对Sepharose 4 Fast Flow凝胶过滤层析参数的筛选,选用不同的洗脱流速、不同的样品上样量、不同缓冲溶液的pH值和不同盐浓度对EV71病毒粗提液进行连续洗脱。结果表明凝胶过滤层析的洗脱流速、样品上样量、缓冲溶液的pH值和盐浓度对EV71病毒均能不同程度地影响EV71病毒的分粗提液的分离效果。在实验范围内,选择洗脱流速为60cm/h、样品的上样量为5%CV、缓冲溶液的pH值为7.5和盐浓度为0.1mol/L时,对EV71病毒原液的分离效果比较理想。接着选用了Q Sepharose XL阴离子胶作为层析介质来纯化EV71病毒原液。影响离子交换层析的因素有离子强度、pH、温度和流速等,本文主要探讨了离子强度和pH对离子交换制备EV71病毒的影响。先采用线性梯度洗脱法,初步筛选制备EV71病毒平衡缓冲液含氯化钠的浓度范围和洗脱缓冲液中氯化钠的浓度;然后在同一pH条件下,改变平衡缓冲液中氯化钠的含量,计算在每种平衡缓冲液下EV71病毒的效价和滴度,选择最佳的平衡缓冲液的氯化钠的含量;再在同一离子强度条件下,改变pH值,通过计算EV71病毒的效价和滴度,选择最佳pH值。最后通过正交法去验证了不同离子强度和pH值组合,从而筛选出了最佳层析参数。本实验可以看出离子强度和pH值均能不同程度地影响EV71病毒的制备。在实验范围内,平衡缓冲液中含200mmol/L氯化钠和pH为7.5为最佳组合。最后采用先凝胶过滤层析后离子交换层析相结合的方法,运用前面筛选的最佳层析参数,进行实验,得到了制备高纯度的EV71病毒的可行性,获得了满意的结果。该工艺简单、成本低、效价和比活高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 引言
• 1.1 手足口病及EV71 的概况
• 1.2 EV71 的流行病学
• 1.2.1 EV71 的流行历史及在我国的爆发状况
• 1.2.2 EV71 的分子流行病学和基因分型
• 1.2.3 临床症状及致病机制
• 1.2.4 传播途径及流行病学的特点
• 1.3 EV71 病毒的诊断方法
• 1.3.1 病毒的分离与鉴定
• 1.3.2 核酸杂交与RT-PCR 技术
• 1.3.3 血清学实验方法的诊断
• 1.3.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• 1.4 EV71 病毒的生物学性质
• 1.4.1 EV71 病毒的一般性状
• 1.4.2 EV71 病毒的形态及结构
• 1.4.3 EV71 病毒的基因组结构及编码蛋白
• 1.5 生化分离的简介
• 1.6 凝胶过滤层析的简介
• 1.6.1 凝胶过滤层析的基本原理
• 1.6.2 凝胶过滤层析的特点
• 1.6.3 影响凝胶过滤层析分离效果的主要因素
• 1.6.4 凝胶过滤层析的应用
• 1.7 离子交换层析的简介
• 1.7.1 离子交换层析的基本原理
• 1.7.2 离子交换层析的特点
• 1.7.3 离子交换层析的影响因素
• 1.8 本文的研究方向以及意义
• 1.9 实验思路与方案
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.1.4 常用试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SDS-PAGE 电泳检测
• 2.2.2 蛋白质浓度测定-Lowry 法
• 2.2.3 ELISA 法检测抗原效价
• 2.2.4 凝胶过滤层析
• 2.2.5 Q Sepharose XL 离子交换层析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 凝胶过滤层析制备EV71 病毒的操作以及结果
• 3.1.1 洗脱流速对EV71 病毒粗提液分离效果的影响
• 3.1.2 样品上样量对EV71 病毒粗提液分离效果的影响
• 3.1.3 缓冲液pH 值以及盐浓度对EV71 病毒粗提液分离效果的影响
• 3.2 Q Sepharose XL 离子交换层析制备EV71 结果与分析
• 3.2.1 离子交换层析制备EV71 条件的摸索及结果
• 3.2.2 离子交换层析条件的优化
• 3.2.3 pH 值对离子交换层析制备EV71 条件的影响
• 3.2.4 运用正交法选择合适离子强度和pH 值组合
• 3.3 讨论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文