苜蓿干旱诱导相关基因的克隆和功能分析

论文摘要

本试验以公农三号根蘖型苜蓿为试验材料。经过温室条件下盆栽试验和人为干旱条件的施加,用mRNA差异显示技术分析干旱胁迫下苜蓿基因表达与正常供给水分的苜蓿基因表达的差异片断。通过斑点杂交技术筛选得到的基因片断,得到差异片断后对其进行序列测定和分析等研究,得到以下结果:1、由于苜蓿具有扦插易成活的特性,在温室条件并且水分温度控制适当的情况下,无性扦插苜蓿的成活率可以达到90%。故利用盆栽和无性繁殖得到同一株系的植株,采用不同的处理和梯度来进行胁迫,并用分子生物学的方法进行分析,是对苜蓿进行基因表达研究一项可行的方案。这种方案比较对同一植株在逆境施加前后分别取样来进行分析比较,尤其是当胁迫处理需要较长时间的时候或者试验对象生命周期比较短的情况下,可以有效地降低由于生育阶段改变而造成的假阳性。2、苜蓿在进行一段时间的干旱胁迫后,会出现基因的差异表达。在对苜蓿进行半个月的萎蔫-复原胁迫。诱导苜蓿基因中的抗旱基因表达。通过RNA的提取和mRNA差异显示技术筛选一共得到苜蓿的差异表达片断32条。干旱胁迫诱导了公农三号根蘖型苜蓿抗逆机制的表达。3、建立苜蓿基因差异表达研究体系。理论上,通过简并的3条锚定引物和8条随机引物,即能够覆盖所有的mRNA,扩增出所有的mRNA片断,本试验利用3条锚定引物和10条随机引物组合,通过DDRT-PCR方法研究正常和干旱胁迫下苜蓿的基因差异表达。并通过Reverse Northern杂交技术有效地筛选和排除DDRT-PCR技术得到的真、假阳性片断。4、通过DDRT-PCR技术和Reverse Northern技术结合,筛选得到三条苜蓿受干旱胁迫后差异表达的基因片断。经过克隆和基因序列测定,互联网基因数据库比对。其中,一个与基因库中拟南芥水通道蛋白（water channel）控制基因同源性达到99%,为干旱诱导表达的重要基因。另外两个基因片断与其它基因的同源性都比较低,可能为干旱诱导表达的新基因,有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 苜蓿简介
• 1.2 试验原理简介
• 1.3 苜蓿抗旱研究进展
• 1.3.1 苜蓿抗旱性及抗旱生理研究进展
• 1.3.2 国内、外苜蓿抗旱育种研究进展
• 1.3.3 苜蓿抗旱育种技术手段及方法研究进展
• 1.4 mRNA差异显示技术
• 1.4.1 mRNA差别显示技术的基本原理
• 1.4.2 mRNA差别显示技术的优点与局限性
• 1.4.3 mRNA差异显示法的改进与完善
• 第二章 试验仪器材料和试验方法
• 2.1 试验仪器设备
• 2.2 试验试剂
• 2.3 引物
• 2.4 试验所用溶液的配制
• 2.5 试验材料
• 2.6 试验方案
• 2.7 试验具体步骤
• 2.7.1 总RNA的提取
• 2.7.2 RT反应
• 2.7.3 PCR反应
• 2.7.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片断
• 2.7.5 差异片段的回收及第二次PCR扩增
• 2.7.6 差异片断的克隆
• 2.7.7 差异序列的Reverse Northern斑点杂交
• 2.7.8 阳性差异片断的序列测定
• 2.7.9 差异片断序列与基因数据库中的序列同源性比较
• 第三章 结果与分析
• 3.1 利用Takara的RNAiso Reagent提取苜蓿叶片RNA
• 3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片断
• 3.3 差异片断的二次PCR产物
• 3.4 重组质粒克隆后的蓝白斑鉴定
• 3.5 重组质粒的PCR鉴定结果
• 3.6 Reverse Northern Blotting判断真、假阳性片断
• 3.7 差异片断分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介