LPS通过NADPH氧化酶和TLR2途径促进HUVECs表达MCP-1和ICAM-1

论文摘要

[目的]动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）被认为是一种慢性炎症性疾病,伴有免疫反应的炎症过程贯穿于As发生、发展的始终。细菌内毒素是引起血管炎症的一个潜在的重要危险因素。Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）介导天然免疫,与As炎症反应相关,最近的研究发现,Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）在As的发生、发展中发挥着重要作用。氧化应激即活性氧（reactive oxygen species, ROS）的蓄积,可诱导炎症基因表达,促进As的发生、发展。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶是血管细胞产生ROS的主要来源,可做为第二信使,在多条细胞信号转导通路中发挥重要作用。本课题以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）为研究对象,以LPS为干预因素,观察NADPH氧化酶—TLR2途径对HUVECs单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）表达的影响。[方法]不同浓度（0 ng/ml,12.5 ng/ml,25 ng/ml,50 ng/ml,100 ng/ml）的LPS孵育HUVECs 8h,逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）和Western blotting方法分别检测TLR2 mRNA和蛋白的表达水平,遴选最佳实验浓度。25 ng/ml LPS孵育HUVECs不同时间（0h,0.5h,1h,2h,4h,8h）,RT-PCR和Western blotting方法分别检测TLR2 mRNA和蛋白的表达水平,遴选最佳实验时间。25 ng/ml LPS孵育HUVECs不同时间（0min,20min,40min,60min,120min,240min）,NBT还原实验检测NADPH氧化酶的活性,RT-PCR方法检测NADPH氧化酶亚单位p22phox、p67phox和Rac-1的mRNA表达水平。10 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（acetylcysteine, NAC）、100 umol/L夹竹桃麻素（apocynin, APO）或30 umol/L二甲苯基碘（diphenylene iodonium chloride, DPI）预处理HUVECs 0.5h,再以25 ng/ml LPS孵育HUVECs 2h,RT-PCR和Western blotting方法分别检测TLR2 mRNA和蛋白的表达水平。10 mmol/L NAC、100 umol/L APO或30 umol/L DPI预处理HUVECs 0.5h,再以25 ng/ml LPS孵育HUVECs 8h,RT-PCR方法检测MCP-1和ICAM-1mRNA的表达水平。10 ug/ml TLR2阻断抗体或对照抗体预处理HUVECs 0.5h,再以25 ng/ml LPS孵育HUVECs 8h,RT-PCR和Western blotting方法分别检测MCP-1、ICAM-1 mRNA或蛋白的表达水平。[结果]LPS孵育HUVECs后,TLR2 mRNA和蛋白的表达上调,最佳实验浓度为25 ng/ml,最佳实验时间为2h。LPS处理HUVECs不同时间后,NADPH氧化酶的活性先升高后降低,且其亚单位p22phox、p67phox和Rac-1的mRNA表达水平的变化与其一致。NAC、APO或DPI预处理、LPS孵育HUVECs后,TLR2 mRNA和蛋白的表达下调。NAC、APO或DPI预处理、LPS孵育HUVECs后,MCP-1、ICAM-1 mRNA的表达下调。TLR2阻断抗体预处理、LPS孵育HUVECs后,MCP-1、ICAM-1 mRNA或蛋白的表达下调。[结论]LPS诱导HUVECs表达TLR2,NADPH氧化酶调节HUVECs TLR2的表达。LPS诱导HUVECs表达MCP-1和ICAM-1,NADPH氧化酶和TLR2相途径调节HUVECs MCP-1和ICAM-1的表达。

论文目录

• 英文缩写索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 实验材料与实验方法
• 1. 细胞与试剂
• 2. 实验仪器
• 3. 细胞培养
• 4. RT-PCR方法检测mRNA表达
• 5. Western blotting方法检测蛋白表达
• 6. NBT还原实验检测NADPH氧化酶活性
• 7. 统计学处理
• 实验设计与实验结果
• 实验一:LPS影响 HUVECs TLR2 mRNA和蛋白表达的量效实验
• 实验二:LPS影响HUVECs TLR2 mRNA和蛋白表达的时效实验
• 实验三:LPS对HUVECs NADPH氧化酶活性的影响
• 实验四:LPS对HUVECs NADPH氧化酶亚单位 p22phox、p67phox和Rac-1 mRNA表达的影响
• 实验五:LPS、NAC、APO和DPI对HUVECs TLR2 mRNA和蛋白表达的影响
• 实验六:LPS、NAC、APO 和 DPI 对 HUVECs MCP-1 和 ICAM-1mRNA 表达的影响
• 实验七:LPS和TLR2阻断抗体对HUVECs MCP-1、ICAM-1 mRNA或蛋白表达的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 硕士生期间发表的论文
• 致谢