miR-27a、miR-143对猪脂肪沉积和miR-1、miR-206对肌肉肥大的调控研究

论文摘要

MicroRNA（miRNA）是一类约20-25nt的小分子核苷酸,在多种生物学过程：如细胞增殖、凋亡、生长、分化和代谢等中起重要调控功能。研究表明miRNA在脂肪和肌肉细胞生长发育过程中起了重要作用,本研究选取在其他物种中对肌肉细胞肥大萎缩有明显功能的miR-1.miR-206和调节脂肪细胞脂质代谢的miR-27a.miR-143进行功能验证,实验通过将mimic、inhibitor瞬时转染进猪成熟脂肪和肌肉细胞,测定转染后脂肪和肌肉细胞的表型指标,肌肉细胞的表型指标用肌管直径表示；脂肪细胞的表型包括：甘油三酯,甘油,游离脂肪酸及总蛋白的检测,从而研究特定miRNA对猪肌肉细胞肥大萎缩和脂肪细胞脂质代谢的功能。结果表明：在脂肪细胞在诱导成脂的过程中在0.1μmol/L地塞米松、50nmol/L胰岛素、0.25mmol/L IBMX的组合下诱导率和诱导速度最佳；转染过程中转染试剂、转染试剂的浓度、探针浓度都可以影响转染效率和细胞活性,通过数据分析得到本实验条件下最佳的转染体系为：使用LipofectamineTM 2000进行转染,转染试剂和探针的实验量分别为1.4ul/cm2和100nM。在肌肉细胞在诱导成肌管的过程中在使用20%胎牛血清培养基与2%马血清培养基组合下诱导率和诱导速度最佳；转染过程中转染试剂、转染试剂的浓度、探针浓度都可以影响转染效率和细胞活性,通过数据分析得到本实验条件下最佳的转染体系为：使用DharmaFECT（?）Trarlsfection Reagent进行转染,转染试剂和探针的实验量分别为1.33μL/cm2和100nM。转染了mimic27a的成熟脂肪细胞甘油三酯合成受到抑制,甘油,游离脂肪酸的合成受到促进,转染了inhibitor27a的成熟脂肪细胞得到的结果恰好相反；而转染了mimic143的成熟脂肪细胞甘油三酯合成受到促进,甘油,游离脂肪酸的合成受到抑制,转染了inhibitor 143的成熟脂肪细胞得到的结果恰好相反。即miR-27a抑制脂肪沉积,miR-143促进了脂肪沉积。在成熟肌肉细胞的转染过程中,转染目的基因miR-1和miR-206组与negative control组相比,肌管直径都没有显著差异,导致这样结果的原因可能是转染体系不合适和肌管直径测量方法的不准确。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 miRNA的研究进展
• 1.1.1 miRNA的发现
• 1.1.2 动物体miRNA与siRNA的区别
• 1.1.3 miRNA的特征
• 1.1.4 miRNA的作用机制
• 1.1.5 猪miRNA的研究进展
• 1.2 猪出生后的体脂沉积——脂肪细胞的分化增殖和肥大
• 1.2.1 猪脂肪沉积的一般规律
• 1.2.2 脂肪细胞的肥大
• 1.2.3 成熟脂肪细胞的形成
• 1.2.4 影响脂肪生长发育的miRNA
• 1.3 猪出生后骨骼肌的生长发育——肌纤维肥大
• 1.3.1 肌卫星细胞与骨骼肌的生长
• 1.3.2 生长轴调控骨骼肌的生长
• 1.3.3 成肌细胞的分化过程
• 1.3.4 影响骨骼肌生长发育的miRNA
• 1.4 细胞转染技术的发展与现状
• 1.4.1 基因转染的方法
• 1.4.2 转染方法的选择
• 1.4.3 脂质体转染过程遇到的问题
• 1.4.4 影响转染效率的因素
• 1.5 本实验的研究内容和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验时间与地点
• 2.2 实验动物
• 2.3 实验试剂
• 2.4 主要仪器设备
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 细胞原代培养（前脂肪细胞和成肌细胞）
• 2.5.2 细胞传代
• 2.5.3 细胞诱导分化
• 2.5.4 细胞生长曲线绘制
• 2.5.5 细胞转染（以mimic为例,inhibitor方法一样）
• 2.5.6 表型指标检测
• 3.结果与分析
• 3.1 细胞生长曲线绘制
• 3.2 脂肪细胞与肌肉细胞诱导
• 3.3 成熟脂肪细胞和成熟肌细胞转染条件优化
• 3.3.1 成熟脂肪细胞转染优化
• 3.3.2 成熟肌细胞转染优化
• 3.4 成熟脂肪细胞转染miR-27a、miR-143后生化指标检测结果
• 3.4.1 miR-27a对猪脂肪细胞脂质代谢的影响
• 3.4.2 miR-143对猪脂肪细胞脂质代谢的影响
• 3.4.3 miR-27a、miR-143对猪脂肪细胞脂质代谢影响的显著性比较
• 3.5 肌肉细胞的测量结果
• 4.讨论
• 4.1 脂肪和肌肉细胞原代培养,诱导和转染体系的建立
• 4.1.1 脂肪细胞原代培养,诱导和转染体系的建立
• 4.1.2 肌肉细胞原代培养,诱导和转染体系的建立
• 4.2 miR-27a和miR-143对猪脂肪细胞脂质代谢的影响
• 4.2.1 miR-27a对猪脂肪细胞脂质代谢的影响
• 4.2.2 miR-143对猪脂肪细胞脂质代谢的影响
• 4.3 miR-1和miR-206对肌肉细胞肥大和萎缩的影响
• 5.结论
• 5.1 脂肪细胞原代培养,诱导和转染体系的建立
• 5.2 肌肉细胞原代培养,诱导和转染体系的建立
• 5.3 miR-27a和miR-143对猪脂肪细胞脂质代谢影响
• 6.参考文献
• 致谢