喜树sls-like基因启动子的克隆及分析

论文摘要

喜树碱（Camptothecin,CPT）是喜树体内（camptothecia acuminate）具有抗肿瘤特性的次生代谢产物。它在植物体内的合成涉及到很多酶的参与。其中次番木鳖苷合成酶（Secologanin synthase,SLS）是喜树碱合成过程中的重要限速酶之一。我们实验室在前期工作中,首次从喜树中克隆出一个与编码次番木鳖苷合成酶sls基因相似的基因（sls-like）,本文的目的是克隆sls-like基因启动子,有助于今后了解sls-like基因的表达调控机制。本实验利用LA-PCR技术成功的从喜树基因组中克隆出了sls-like基因的5’端上游序列846bp。通过启动子软件分析,该序列中转录起始位点（A）距离起始密码子ATG上游126bp处。-29bp处含有TATA box,-92bp处含有CAAT box。另外还观察到一些与光调节有关的元件,如：GATA Box,以及数个胁迫应答元件,如：motif Ⅱb。此外在转录起始位点下游还观察到一个CT富集区。我们把扩增出的5’端上游全长684bp启动子序列进行酶切后获得520bp,382bp、283bp三条启动子缺失片段。以gus基因作为报告基因,构建了四个长度不等的启动子表达载体,然后利用农杆菌为介导转化了烟草,获得了含有4类不同长度序列启动子的转基因烟草,接着检测了这4类转基因叶片中的GUS活性。结果表明,全长684bp序列启动报告基因表达的能力最强,520bp和382bp缺失序列仍然有一定的启动能力,而283bp几乎没有启动能力。本实验结果清楚得表明了我们成功的克隆了sls-like基因的启动子序列。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 喜树及喜树碱研究概况
• 1.1.1 喜树概况
• 1.1.2 喜树碱发展研究概况
• 1.1.3 喜树碱的抗癌机理
• 1.1.4 喜树碱合成过程中关键酶基因研究的背景简介
• 1.1.5 喜树碱的生物合成途径
• 1.1.6 喜树碱合成过程中重要的限速酶
• 1.2 植物基因启动子的研究
• 1.2.1 启动子的概念
• 1.2.2 植物基因启动子的结构元件
• 1.2.3 植物基因研究中的常用启动子
• 1.2.4 植物基因常用启动子的研究实例
• 1.3 本实验的研究目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂及试剂盒
• 2.1.3 质粒与菌株
• 2.1.4 引物的设计及合成
• 2.1.5 实验所需常用溶液、试剂及培养基的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 喜树基因组DNA的提取及检测
• 2.2.2 喜树sls-like基因启动子的分离
• 2.2.3 植物表达载体的构建
• 2.2.4 烟草的遗传转化
• 第3章 结果与分析
• 3.1 sls-like基因启动子的分离
• 3.1.1 喜树基因组DNA的提取
• 3.1.2 喜树基因组DNA的酶切
• 3.1.3 sls-like基因启动子片段的扩增
• 3.1.4 sls-like基因启动子片段测序
• 3.1.5 启动子缺失片段的获得
• 3.2 植物表达载体的构建
• 3.2.1 质粒pBI121的提取及酶切
• 3.2.2 植物表达载体的构建
• 3.3 烟草的遗传转化
• 3.3.1 植物表达载体转化农杆菌
• 3.3.2 植物表达载体转化农杆菌的PCR鉴定
• 3.3.3 根癌农杆菌介导的烟草转化
• 3.3.4 转基因烟草GUS的组织化学分析
• 3.3.5 GUS活性的荧光定量
• 第4章 讨论
• 4.1 sls-like基因启动子的特征分析
• 4.2 sls-like基因启动子的功能分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢