烟草种质资源遗传多样性及青枯病抗性基因的分子标记研究

论文题目: 烟草种质资源遗传多样性及青枯病抗性基因的分子标记研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 杨友才

导师: 周清明

关键词: 烟草,遗传多样性,青枯病,抗性基因,分子标记

文献来源: 湖南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 烟草起源于南美洲，是世界性重要的经济作物，作为世界上最大的生产与消费国，烟草在国民经济建设中占有重要地位。关于烟草分子标记技术及遗传多样性在DNA分子水平上的研究，于20世纪90年代中期开始在国内外均作了一些开创性的工作，但与其他作物相比，仍存在较大的差距。相对应用较多的只有RAPD标记，其他遗传标记的研究极少见。本研究试图从建立烟草基因组DNA多态性分析的RAPD、AFLP标记方法着手，并用建立的标记技术来研究烟草种质资源的遗传亲缘关系，并用BSA分析法对烟草青枯病的抗性基因进行了RAPD标记分析。本研究主要结果有：（1）采用CTAB法和SDS法提取烟草基因组DNA，经检测，结果表明：SDS法提取的基因组DNA的OD260／OD280值都在1.6左右，纯度不如CTAB法提取的高，CTAB法提取的基因组DNA，其OD260／OD280值都在1.8以上，相对分子量在21kb左右，且能完全被EcoRⅠ和MseⅠ酶切消化，并能获得清晰的AFLP指纹图谱。运用改良CTAB法可以获得适于烟草AFLP分析用的高质量的基因组DNA。（2）通过对影响烟草RAPD反应的主要因子，包括DNA模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、循环次数（次）、退火温度（℃）等进行研究，建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系，即在25μl反应体系中模板含量为40ng；引物浓度为30ng／25μl：Mg2+浓度为2.5mmol／L；dNTP浓度为0.25mmol／L；Taq DNA聚合酶用量为1U；其最佳循环数为39，退火温度为38℃。扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃变性1min，38℃1min，72℃1.5min，39个循环：最后72℃延伸5min。（3）通过对AFLP分析过程中的包括DNA模板质量与浓度、MseⅠ和EcoRⅠ以及T4DNA连接酶的浓度、反应时间和反应温度，以及反应体系的组成等影响因素进行了研究。建立了一种适于烟草分析的AFLP银染技术体系。该体系中各优化因素为：模板DNA的用量为400ng，酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ各加入4U，T4 DNA连接酶加入2.8U，采用酶切与连接在同一体系中一步完成，其酶切连接温度为37℃，反应时间为7h。并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测，以引物E-ACA／M-CAC构建了烟草种质资源的AFLP指纹图谱，该图谱扩增带多，多态性强，条带清晰可辩。（4）从200条10bp的RAPD引物中筛选获得28条多态性引物，通过对48份烟草种质资源的基因组DNA进行扩增。共获得184条DNA扩增片断带，其中多态性带86条，平均每个引物扩增出6.5条带，多态性带3条，平均多态检出率为46.7％。用4对AFLP选择性扩增引物对48份烟草材料进行选择性扩增，共获得321条扩增带，其中174条具有多态性，平均每对引物获得80.2条扩增带，多态性带43.5条，平均多态检出率为54.2％。从每对引物扩增出的带数、具多态性带数以及多态性比例来看，AFLP银染标记技术由于其对多态性检出的高效性和良好的重复性，将成为烟草种质资源遗传多样性及系统演化研究的有效手段。（5）根据RAPD和AFLP标记的结果，采用UPGMA法进行聚类分析，两种方法获得了相似但不完全相同的结果，两者都可以将48份烟草资源分为两大类群，即黄花烟草群和普通烟草群，普通烟草可进一步分为4组；48份材料的遗传距离变幅在1.41～11.0之间，其聚类结果与理论上所期望的结果基本一致，但AFLP标记技术比RAPD标记技术能更好地从分子水平揭示我国烟草品种资源的遗传背景、亲缘关系及演化规律。（6）采用温室苗期叶片人工注射接种法对生产上的烟草主栽品种进行青枯病抗性鉴定，结果显示Ti448A，D101，G80三个品种对青枯病表现高抗；表现中抗的有NC82、中烟90等17个，大部分品种表现感病或高感，没有发现免疫品种。（7）通过选用高感青枯病品种红花大金元作母本与高抗青枯病品种Ti448A作父本进行杂交，经对两亲本及其杂交后代F1、F2、BC1P1代进行抗病性鉴定，研究青枯病抗性基因的遗传规律，结果表明，抗病亲本材料Ti448A的抗病性由一对显性基因控制。（8）依据混合群体分组分析法（BSA）建立抗青枯病基因池和感青枯病基因池，通过RAPD试验，从近200个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物S503，用双亲、F1、F2单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记，利用JOINMAP（version 1.4）软件计算得此标记与抗青枯病基因间的重组率为5.984％，连锁距离为6.261cM。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

缩写词

第一章 文献综述及前言

第一节 烟草种质资源研究概述

1 引言

2 烟草种质资源的类型和特点

2.1 烤烟品种资源

2.2 晒晾烟品种资源

2.3 白肋烟品种资源

2.4 雪茄烟品种资源

2.5 香料烟品种资源

2.6 黄花烟品种资源

2.7 野生烟资源

3 烟草种质资源的研究与利用

3.1 烟草种质资源的收集

3.2 烟草种质资源的研究

3.3 烟草种质资源的利用

3.3.1 优良品种在生产上的直接利用

3.3.2 优异种质在育种上的利用

4 我国烟草种质资源工作中存在的主要问题

4.1 资源数量多，但研究深度不够

4.2 种质结构比较单一，资源质量不高

4.3 特异资源多，优异资源少

4.4 人力、物力与财力投入不够

5 我国烟草种质资源研究战略与展望

5.1 广泛搜集各类烟草种质资源

5.2 全面鉴定，深入研究

5.3 重视资源的改造与创新，加速优异种质的开拓利用

参考文献

第二节 分子标记技术概述及其在烟草上的应用研究进展

1 引言

2 分子标记技术的分类

2.1 几种常用的分子标记技术

2.1.1 限制性片段长度多态性技术

2.1.2 随机扩增多态性 DNA技术

2.1.3 已标记序列扩增带技术

2.1.4 扩增片段长度多态性技术

2.1.5 简单序列重复技术

2.1.6 表达序列标定

2.1.7 STS技术

2.1.8 CAPS技术

2.2 几种常见 DNA标记技术的比较

3 分子标记技术的应用

3.1 植物分类学及遗传多样性研究

3.2 基因定位

3.3 构建遗传图谱

3.4 种质资源鉴定

3.5 辅助选择育种

3.6 杂种优势分析与预测

4 分子标记技术的发展前景展望

5 分子标记技术在烟草研究中的应用及前景展望

5.1 分子标记技术在烟草品种资源研究中的应用

5.1.1 烟草种质资源的遗传多样性研究

5.1.2 绘制烟草品种指纹图谱及纯度鉴定

5.1.3 种质资源的创新与鉴定

5.1.4 构建遗传图谱

5.1.5 遗传变异的识别

5.2 分子标记技术应用于重要目标性状基因的定位、分离与转移

5.2.1 群体分离分析和鉴定

5.2.2 标记辅助选择

5.3 分子标记技术应用于烟草相关生物的分类与鉴定

5.3.1 黑胫病菌全基因组DNA遗传多态性RAPD标记

5.3.2 根结线虫种类的鉴定

5.3.3 赤星病菌的分类地位分析

5.4 分子标记技术应用于烟草的前景

6 本研究的目的与意义

参考文献

第二章 烟草种质资源 AFLP分析中DNA模板的制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 主要试剂

1.3 方法

1.3.1 烟草基因组 DNA的提取

1.3.2 烟草基因组 DNA产量、质量的检测

2 结果与分析

2.1 两种 DNA提取方法所提烟草DNA产量和质量的比较

2.1.1 紫外吸收检测结果

2.1.2 电泳检测结果

2.2 两种方法所提 DNA的酶切效果分析

2.3 CTAB法所提 DNA的AFLP扩增效果分析

3 讨论

参考文献

第三章 烟草 RAPD反应体系的建立与优化

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.2 烟草基因组 DNA的提取及检测方法

1.3 RAPD反应条件的优化

1.4 检测方法

2 结果与分析

2.1 模板 DNA含量对 RAPD反应的影响

2.2 引物浓度和Mg~(2+)浓度对 RAPD反应的影响

2.3 Mg~(2+)浓度和dNTP浓度对 RAPD反应的影响

2.4 Taq DNA聚合酶用量对 RAPD反应的影响

2.5 扩增循环数对 RAPD反应的影响

2.6 退火温度对 RAPD反应的影响

3 小结与讨论

3.1 烟草 RAPD反应体系和反应的程序的建立

3.2 RAPD反应的稳定性与可靠性

参考文献

第四章 烟草AFLP银染技术体系与品种指纹图谱的建立

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料

1.1.2 主要试剂

1.2 试验设计与方法

1.2.1 基因组 DNA的提取

1.2.2 基因组 DNA质量与用量对酶切反应的影响

1.2.3 基因组 DNA的酶切条件摸索

1.2.4 连接条件的摸索

1.2.5 酶切连接反应体系的摸索

1.2.6 预扩增反应

1.2.7 选择性扩增反应

1.3 检测方法

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测

1.3.2 PCR产物的银染检测

2 结果与分析

2.1 影响烟草AFLP分析体系的因素

2.1.1 模板 DNA质量和用量对酶切反应的影响

2.1.2 酶切时间对酶切反应的影响

2.1.3 酶浓度对酶切反应的影响

2.1.4 酶切温度对酶切反应的影响

2.1.5 连接酶浓度对反应的影响

2.1.6 连接温度对反应的影响

2.1.7 酶切与连接体系对反应的影响

2.2 烟草AFLP分析体系的建立

2.3 烟草AFLP银染技术体系在指纹图谱构建中的应用

3 小结与讨论

参考文献

第五章 烟草种质资源遗传多样性与亲缘关系的RAPD和AFLP分析

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 材料

1.1.2 试剂

1.1.3 引物

1.2 试验方法

1.2.1 烟草基因组DNA的提取及检测方法

1.2.2 RAPD和 AFLP分析

1.2.3 引物筛选

1.2.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 引物筛选

2.1.1 RAPD引物筛选

2.1.2 AFLP引物筛选

2.2 扩增结果

2.2.1 RAPD扩增结果

2.2.2 AFLP扩增结果

2.3 聚类分析结果

2.3.1 遗传距离分析

2.3.2 聚类分析

3 讨论

3.1 RAPD和 AFLP标记在烟草种质资源研究中的应用

3.2 烟草种质资源的遗传多样性

参考文献

第六章 烟草品种青枯病抗性鉴定及抗性基因的RAPD标记研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试品种

1.1.2 供试菌株

1.2 方法

1.2.1 抗性鉴定方法

1.2.2 分离群体建立

1.2.3 遗传分析

1.2.4 DNA的提取和 RAPD扩增反应

1.2.5 多态性随机引物筛选和标记位点的寻找

1.2.6 数据分析

2. 结果与分析

2.1 抗病性鉴定结果和抗性遗传分析

2.1.1 烟草品种抗性

2.1.2 烟草品种抗性遗传分析

2.2 BSA分析结果

3 讨论

3.1 关于青枯病抗性鉴定的方法

3.2 关于青枯病抗性的遗传机制

3.3 关于BSA法寻找与青枯病抗性基因连锁的标记

参考文献

第七章 结论与结语

1 结论

2 主要创新之处

3 展望

附录

致谢

在读期间的主要成果

发布时间: 2007-12-06

参考文献

• [1].白肋型烟草叶色基因的分子标记与烟草种质遗传多样性研究[D]. 杜传印.山东农业大学2006
• [2].烟草（N.tabacum L.）高香气特征性状的鉴定及其分子标记研究[D]. 任民.中国农业科学院2008
• [3].烟草种质ISSR标记及对氮素响应的生理遗传与差异蛋白质组学研究[D]. 梁景霞.福建农林大学2008

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• [3].白肋型烟草叶色基因的分子标记与烟草种质遗传多样性研究[D]. 杜传印.山东农业大学2006
• [4].花生抗青枯病种质的遗传多样性及抗性分子标记[D]. 姜慧芳.华中农业大学2006
• [5].马铃薯青枯病抗性相关基因的分离及其功能分析[D]. 李广存.中国农业科学院2006
• [6].红麻种质资源遗传多样性及其分子标记研究[D]. 李爱青.湖南农业大学2006
• [7].鸭茅种质资源遗传多样性的分子标记及优异种质评价[D]. 曾兵.四川农业大学2007
• [8].烟草内生细菌及其对烟草青枯病的防治作用研究[D]. 易有金.湖南农业大学2007
• [9].番茄抗青枯病的AFLP分子标记及其相关基因的克隆[D]. 苗立祥.浙江大学2008
• [10].烟草（N.tabacum L.）高香气特征性状的鉴定及其分子标记研究[D]. 任民.中国农业科学院2008

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