单抗鉴定SARS冠状病毒结构蛋白B细胞表位的研究

论文摘要

抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。因此目前在预防医学领域许多关于以表位为基础的如表位疫苗和特异性诊断试剂等的研究也就成了热点,而使用单克隆抗体作为近年来新兴起的研究蛋白质抗原表位的有利工具,已经成功地鉴定出了多种病原微生物的抗原表位。这就为揭示一些病原体未知的抗原表位,从而进一步达到预防和控制疾病的发生提供了条件。 2002年11月,第一例严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）病例在中国广东省佛山市出现。之后,SARS迅速传播至其它国家和地区,导致数千人死亡。基于世界卫生组织（WHO）的协调,在世界范围内由十三个实验室成立了SARS研究网络,在他们的通力合作下,WHO于2003年4月16日宣布SARS的病源是一种新的冠状病毒,命名为SARS冠状病毒（SARS-CoV）。SARS-CoV是一种单链正义RNA病毒,有囊膜。病毒基因组约29.7Kb,基因组结构特征与其他冠状病毒相似,有11个开放阅读框,主要结构蛋白有纤突蛋白（spike protein,S）、囊膜蛋白（membrane protein,M）、小囊膜蛋白（envelope protein,E）、核蛋白（N）和无HE蛋白。SARS-CoV的基因序列和蛋白的氨基酸序列与其他已知的冠状病毒同源性很低。S、M、N蛋白是SARS-CoV的三种主要结构蛋白,S是病毒粒子最主要的结构蛋白,它在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导产生中和抗体方面起重要作用。 在本实验中,参照已发表的SARS冠状病毒BJ01株基因序列（29725bp）,利用生物信息学软件预测并选取该病毒S、M、N三种主要结构蛋白部分抗原性优势区域以编码Gly-Pro-Gly序列相连接合成两段嵌合基因A和B,并分别克隆于原核表达质粒pGEX-6p-1的多克隆位点BamH Ⅰ与Xho Ⅰ之间,用IPTG进行诱导表达,以纯化的嵌合蛋白A和B为抗原,分别免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。利用SARS-CoV商品化ELISA检测试剂盒对其进行特异性鉴定。结果表明融合表达两段嵌合基因产物,其大小分别为34kD和35kD,Western blot分析证实两种表达产物都能被SARS病人康复期血清所识别。获得多株单抗,鉴定得到了6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞克隆株:A1F4、A2B3、A2B7、A2D5、D3C5、D3D1。特异性鉴定发现除D3D1外,其余的5株单抗均能与SARS-CoV商品化ELISA检测试剂盒发生特异性反应。将D3D1与灭活后经超声波裂解的SARS-CoV进行Western blot分析,发现它能特异性识别180kD的蛋白带。分别融合表达6个S蛋白的寡肽（S1-S6）以及M1、M2、N1、N2蛋白寡肽,对筛选出的单克隆抗体相对应的抗原表位通过ELISA进行了初步鉴定。结果发现单克隆抗体D3D1特异性识别S2基因表达产物(S

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 抗原表位的研究
• 1.1.1 基于表位的疫苗研究
• 1.1.2 基于表位的诊断研究
• 1.1.3 识别抗原表位的方法
• 1.1.4 噬菌体展示技术
• 1.2 SARS-Cov的表位研究概述
• 1.2.1 SARS-Cov基因组
• 1.2.2 S蛋白的生物学功能
• 1.2.3 M蛋白的生物学功能
• 1.2.4 N蛋白的生物学功能
• 2. 研究目的和意义
• 3. 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 质粒和受体菌
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 嵌合基因的合成
• 3.2.2 嵌合基因的克隆
• 3.2.3 阳性重组子的筛选与鉴定
• 3.2.4 目的蛋白的诱导表达
• 3.2.5 目的蛋白的分析
• 3.2.6 单克隆抗体的特异性鉴定
• 3.2.7 抗原表位的初步鉴定
• 4. 结果与分析
• 4.1 嵌合基因的表达与鉴定
• 4.1.1 嵌合基因的合成
• 4.1.2 嵌合基因表达载体的构建
• 4.2 单克隆抗体的特异性的鉴定
• 4.3 抗原表位的初步鉴定
• 4.3.1 嵌合基因的拆分表达
• 4.3.2 夹心 ELISA
• 4.3.3 Western blot分析
• 5. 讨论
• 6. 结论
• 参考文献
• 致谢