山东省畜禽魏氏梭菌分子流行病学研究

论文摘要

根据GenBank上发表的α毒素基因序列,参照公开发表物设计了一对引物,扩增出1条325bp的特异性扩增条带,建立了魏氏梭菌α毒素基因聚合酶链式反应的检测方法。用该方法对沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌和葡萄球菌扩增,结果表明:仅魏氏梭菌扩增出了特异性条带,最低能检测到模板浓度为100CFU/ml,说明该方法具有很高的特异性和敏感性,是魏氏梭菌的一种快速、简便的鉴定方法,具有很高的推广应用价值。利用此方法对攻毒老鼠、病兔组织提取的DNA进行α毒素基因检测,以肝脏的检出率最高,脾、肾、心、肺、肠次之。根据GeriBank上发表魏氏梭菌的α、β、ε、ι四种主要毒素基因的序列及公开发表物设计四对特异性引物,该引物对标准菌株可扩增出特异性条带,将扩增产物测序,结果完全和报道的序列一致,建立了检验魏氏梭菌血清型的多重聚合酶链反应（multi-PCR）方法。另外对标准大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、肠球菌在相同的反应体系中进行扩增,没有扩增出特异性产物,说明该方法具有较高的特异性。敏感性实验结果表明,该Multi-PCR最低能检测到5.0×105CFU/ml,由此可见,本文所建立的多重聚合酶链反应（multi-PCR）方法具有较高的特异性、敏感性,可以用于临床的检测。纯化上述α毒素PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记α毒素基因探针。该探针与五个血清型的魏氏梭菌均能发生特异性杂交,而与对沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌和葡萄球菌的核酸杂交均为阴性。对魏氏梭菌最低能检测到5×103个,利用此方法对攻毒老鼠、病兔组织提取的DNA进行检测,以肠、肝脏、脾、肾的检出率较高。从山东泰安、德州、临沂、青岛、蒙阴、济南等地畜舍粪便、发病动物肠内容物中分离到131株魏氏梭菌,通过多重聚合酶链反应（multi-PCR）对分离到的魏氏梭菌进行型别的鉴定,结果发现:分离到的魏氏梭菌均为A型。从山东省泰安、莱芜的狐狸舍、猪舍、兔舍空气中分离魏氏梭菌,从空气中分离到43株,通过多重聚合酶链反应对分离到的魏氏梭菌进行型别的鉴定,结果发现:分离到的魏氏梭菌均为A型。对山东省泰安等地的5起兔的腹泻疫情进行临床诊断,根据初步诊断结果进行了病原的分离培养,可疑菌经多重PCR鉴定为A型魏氏梭菌。根据疫情报爆发时出现的临床

论文目录

• 英文缩略表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1 魏氏梭菌简介
• 2 我国魏氏梭菌病的流行及危害
• 3 病原的分子流行病学研究的意义
• 4 魏氏梭菌毒力因子
• 5 α毒素的研究进展
• 第二章 魏氏梭菌 PCR 诊断方法的建立与应用
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 第三章 多重 PCR 检测魏氏梭菌的基因型方法的建立及应用
• 1. 方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第四章 地高平标记探针检测魏氏梭菌的研究与应用
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第五章 家畜粪便、肠内容物中魏氏梭菌的分离培养鉴定及基因型检测
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 结果与分析
• 第六章 动物舍空气中魏氏梭菌的分离及基因型鉴定
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第七章 不同方法对牛舍气载魏氏梭菌型别的研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第八章 腹泻兔魏氏梭菌的分离鉴定及诊断研究
• 1. 发病情况
• 2. 实验室诊断
• 3. 结论与讨论
• 第九章 不同来源的魏氏梭菌的分离株药敏实验和致病性观察
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论与分析
• 第十章 不同来源的魏氏梭菌α毒素全基因序列分析
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第十一章 魏氏梭菌α毒素基因的表达性克隆的构建
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况