磷脂酶D制备磷脂酰甘油的酶学特性研究

论文摘要

本文研究了磷脂酶D在有机溶剂中的催化性能和二级结构,建立了相应的检测方法,并探讨了磷脂酶D在有机溶剂中的构效关系。主要研究内容及结果如下:以log P为量化指标考察了有机溶剂对磷脂酶D催化活力的影响,研究结果显示log P过高或过低的有机溶剂都不利于酶促反应的进行,最佳溶剂为乙醚,其次是乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷。花生磷脂酶D对底物卵磷脂的来源具有选择性,对大豆卵磷脂的催化活力明显高于鸡蛋卵磷脂。通过单因素试验得出较适合的反应条件:酶对底物的质量百分比为2%,底物浓度10mg/ml,离子交换树脂用量100mg/5ml。对磷脂酶D进行预处理可以不同程度提高有机溶剂中的酶活力,但磷脂酶D对Ca2+的需求几乎是必需的,且对Ca2+浓度要求较高,过量的Ca2+会严重抑制酶活力。最佳预处理方法为:Ca2+浓度80mM,98%KCl（盐在冻干粉中的比重越高越好）,pH 5.58。测定了磷脂酶D在不同环境下分子的二级结构,得出磷脂酶D由水溶液冻干后,分子中的二级结构发生变化,主要表现为α螺旋含量下降和β折叠含量上升。大量的盐有助于维持磷脂酶D冻干粉和有机溶剂悬浮液在水溶液中的二级结构,pH状态在冻干粉和悬浮液中得到保留,并反映在对β结构的维持上。磷脂酶D在有机溶剂悬浮液中基本保持了冻干状态的二级结构,但是经过预处理的冻干粉中酶分子的二级结构仍然会受到有机溶剂不同程度的影响,其中苯、甲苯、正己烷和乙腈较氯仿、二氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯影响更明显。建立了HPLC检测混合磷脂样品中PG含量的方法和FTIR测定磷脂酶D分子二级结构的方法,方法准确可靠。利用统计方法研究了磷脂酶D在有机溶剂中的二级结构和酶活力的关系,并建立了磷脂酶D酶分子二级结构（x1:α螺旋,x2:β折叠,x3:β转角,x4:无规卷曲）和有机溶剂（x5:log P）对酶活力（y:PG浓度）影响的多元线性回归模型y = 63.368 + 1.491x1– 2.213x2– 5.207x5和主成分回归模型y = 48.9593 + 0.0249x1– 0.0455x2– 0.0061x3– 0.4601x5.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 磷脂酶D 概述
• 1.1.1 磷脂酶D 的来源
• 1.1.2 磷脂酶D 的催化特性
• 1.1.3 磷脂酶D 的结构及其对催化性能的影响
• 1.1.4 磷脂酶D 的应用
• 1.2 有机溶剂中的酶促反应
• 1.2.1 有机溶剂中酶促反应的特点
• 1.2.2 有机溶剂中酶促反应的影响因素
• 1.2.3 有机溶剂中酶促反应的应用
• 1.3 立题依据和研究内容
• 第二章 磷脂酰甘油的检测和磷脂酶D 二级结构的检测
• 2.1 引言
• 2.1.1 磷脂酰甘油的检测
• 2.1.2 磷脂酶D 二级结构的检测
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 磷脂酰甘油的检测
• 2.3.2 磷脂酶D 二级结构的检测
• 2.4 本章小结
• 第三章 磷脂酶D 在有机溶剂中催化特性的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 实验材料
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.4 检测方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 有机溶剂的筛选
• 3.3.2 磷脂酶D 催化磷脂反应的影响因素
• 3.4 本章小结
• 第四章 磷脂酶D 在不同环境中的二级结构
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 实验材料
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.4 检测方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 冻干过程中pH 的作用
• 4.3.2 冻干过程中盐的影响
• 4.3.3 盐和pH 对磷脂酶D 二级结构的共同影响
• 4.3.4 有机溶剂的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 磷脂酶D 在有机溶剂中的构效关系
• 5.1 引言
• 5.2 基本原理与数据处理方法
• 5.2.1 多元线性回归
• 5.2.2 多重共线性及解决方法
• 5.3 数据处理方法
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 磷脂酶D 在有机溶剂中构效关系的初步预测
• 5.4.2 对建立多元线性回归模型的探讨
• 5.4.3 关于磷脂酶D 在有机溶剂中催化活力的影响因素的主成分回归分析
• 5.5 本章小结
• 结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间发表的文章