论文摘要
本研究以新城疫病毒F48E9株和LaSota株HN结构蛋白的氨基酸序列为依据,先采用Chou-Fasman方法、Garnier-Robson方法、Emini方法、Kyte-Doolittle方法和Karplus-Schulz方法分别预测HN蛋白的二级结构、表面可能性、亲水性和柔韧性,单参数分析HN蛋白的结构和性质;再通过Jameson-Wolf方法,综合不同的参数评价HN蛋白各个部位的抗原性。预测结果显示,新城疫病毒F48E9株与LaSota株HN结构蛋白间共有13个潜在抗原表位存在差异,其中第10个（212-218AA）和第21个（492-498AA）表位的氨基酸序列从峰值上看差异极显著,很可能是新城疫病毒的保护性抗原表位。本研究为进一步通过试验方法确定新城疫病毒HN结构蛋白的保护性抗原表位,研制有效的新城疫疫苗,提供一定的理论依据。HN结构蛋白是构成NDV囊膜表面纤突的主要成分,可以刺激机体产生中和抗体,是NDV的主要保护性抗原之一。为确定HN蛋白保护性抗原表位的位置,本研究进行了HN基因的分段克隆、原核表达以及HN分段重组蛋白的免疫反应性分析。首先,根据Gen Bank数据库中登录的NDV F48E9株HN基因序列及pGEX-4T-1载体多克隆位点序列,设计一对引物,从接种NDV的鸡胚尿囊液中扩增出NDV F48E9株HN全基因。再以HN全基因重组质粒pGEX-4T-1-HNq为模板,根据先前预测的F48E9株与LaSota株HN结构蛋白潜在抗原表位的差异,分别设计四对引物,将HN基因分成连续的4个片段,构建分段表达重组质粒pGEX-4T-1-P225、pGEX-4T-1-P435、pGEX-4T-1-P444和pGEX-4T-1-P558。PCR鉴定和序列测定结果表明,分段表达重组质粒构建成功。其次,诱导原核表达HN基因分段重组蛋白GST-HN225、GST-HN435、GST-HN444和GST-HN558,鉴定表达形式、优化表达条件后,进行大量表达。用反复冻融和超声方法裂解表达菌,提取融合蛋白,再对其进行透析复性、亲和层析纯化。SDS-PAGE电泳检测结果表明,所克隆的4个基因片段在大肠杆菌中得到表达,获得分子量约为33.5KD、40.5KD、40.8KD、44.6KD的融合蛋白,与预期结果相符,并且0.75mmol/LIPTG诱导3h表达效果最好,表达产物以包涵体形式存在。最后,用纯化的HN基因分段重组蛋白GST-HN225、GST-HN435、GST-HN444和GST-HN558免疫小鼠,制备相应的多抗,检测分段重组蛋白的免疫学活性。Westernblotting实验结果表明,分段表达的HN重组蛋白均具有免疫原性和反应原性。综上所述,本研究成功地分段克隆、表达了NDV HN基因,获得了大量纯化的融合蛋白,制备了相应的多抗,并证明了分段表达的HN重组蛋白具有免疫学活性,为进一步确定NDV HN蛋白的保护性抗原表位奠定了基础。
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标签：新城疫病毒论文; 结构蛋白论文; 潜在保护性抗原表位论文; 预测分析论文; 分段克隆表达论文; 免疫学活性分析论文;