论文摘要
原发性肝癌是居中国第二位的恶性肿瘤,每年全世界新发肝癌的一半以上发生在我国。肝癌病人的预后非常差,手术切除被认为是根治肝癌的最好手段,但很多肝癌患者多伴有严重的门脉高压和肝炎肝硬化,由于肝脏代偿功能丧失而失去了手术机会。原位异体肝移植术能在切除肿瘤的同时根治原发灶,已成为治疗原发性肝癌合并肝硬化患者的最佳选择。但是,肝癌肝移植术后复发和转移仍是引起患者死亡和影响肝移植预后的重要原因之一,肿瘤大小、血管侵犯AFP等目前常用的肿瘤的生物学特征指标难以准确预测肝癌肝移植术后转移复发,这将不利于更好地把握肝移植适应症和术后个体化治疗方案的制定。所以,鉴定肝癌肝移植术后转移复发相关的肿瘤分子标记仍然是目前研究的重点。近年来与肝癌发生相关的蛋白质组学研究日益增多,对深刻理解和认识肝癌起到了很大的推进作用,但是,肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关的蛋白质组学研究尚缺乏。通过蛋白质组学可以使我们对肿瘤的发生、发展有了更详尽的理解,并能够通过发现特异的分子标志物宋预测患者预后和治疗效果。运用新的蛋白质组学技术鉴定肿瘤相关分子标记的研究在不断地发展之中。激光显微切割技术（laser capture microdissection LCM）联合同位素标记亲和标签（isotope-codeaffinity tag ICAT）二维液相色谱质谱是近年来出现的用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术,在定量及差异表达检测上有着巨大的优势。这一技术适用于LCM所获样本量相对较少的特点,与LCM技术结合可用于筛选肿瘤相关差异蛋白质,发现具有预测和潜在治疗潜能的关键差异分子。本研究通过对肝癌肝移植患者原发瘤标本进行蛋白质组表达谱差异分析,筛选出一些有潜在应用价值的差异蛋白质,并利用RNA干扰技术对其中的Capn4蛋白进行了体内外功能学验证,发现其可能与肝癌的侵袭转移相关。利用组织芯片技术对Capn4的临床验证发现,Capn4的表达与肝癌的侵袭性相关,Capn4阳性表达可能是肝癌肝移植预后不良的新指标和潜在的治疗新靶点。第一部分肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关分子的定量蛋白质组学分析本部分的目的就是筛查肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关的关键分子。样本取自我院肝癌肝移植标本库,所有样本均有完整的临床病理资料和随访数据资料,肝癌肝移植病人原发瘤标本具有相同的疾病背景,根据临床随访复发与否资料（随访时间两年）,分为复发和未复发组,激光显微切割切取同质肝肿瘤细胞,提取蛋白,分别进行稳定同位素轻、重链标记,液相色谱联合串级质谱（LC-MS/MS）鉴定分析差异蛋白,然后,从样本库中另取一组相同标准的样本,应用real-time PCR、蛋白质免疫印迹、免疫组织化学等不同方法验证选取的上调两倍以上的差异蛋白thioredoxin like 1和calpain small subunit 1（Capn4）和下调两倍以上的差异蛋白plastin 3。结果发现:质谱鉴定出具有轻、重链标记定量信息的差异蛋白149个,经内参β-actin校正数据后,其中表达上调2倍以上蛋白29个,表达下调2倍以上蛋白共23个,按geneontology进行功能分类,发现它们主要参与酶活性（49%）,结合活性（13%）,细胞运动（11%）,信号传导（6%）,转录调控（5%）,酶调节（5%）,转运活性（3%）,凋亡（3%）,和其它（5%）等各方面生物学功能。另取一组与前标准相同的复发和未复发组病人（各20例）,应用real-time PCR检测了上调差异蛋白thioredoxin-like 1和下调差异蛋白plastin 3的转录水平的表达,Western blot和免疫细胞组织化学检测了上调差异蛋白Capn4的蛋白水平表达,发现同质谱鉴定结果相一致,进一步证实了质谱鉴定结果的准确性。结果表明,LCM结合定量蛋白质组学,是可行的较新的蛋白质组学研究策略之一,本研究筛查出一系列肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关差异蛋白,可能作为潜在的移植后转移复发预测新指标和治疗新靶点。第二部分差异蛋白Capn4在不同转移潜能的人肝癌细胞系中的表达和体内外功能验证本部分解析差异蛋白Capn4的生物学功能,观察其是否和肝癌的侵袭性高低相关,是否在肝癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。首先选择Hep3B、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6等4种侵袭转移潜能不同的人肝癌细胞系,应用免疫细胞荧光、real-time PCR、Western blot验证Capn4在不同转移潜能人肝癌细胞系中的表达;然后,应用RNA干扰技术,化学合成三对Capn4的siRNA,以脂质体分别转染至高侵袭转移潜能人肝癌细胞系HCCLM6内,筛选出干扰效果明显的一对siRNA,通过细胞侵袭、运动实验、细胞划痕实验、细胞克隆形成实验、MTT实验、细胞生长周期和凋亡实验等检测,观察目的蛋白Capn4表达下调后对HCCLM6体外生物学行为的影响。此外,我们构建慢病毒RNAi表达载体,并将其转染至HCCLM6内,获得稳定转染细胞株,采用裸鼠皮下接种,在体内进一步验证Capn4表达下调对侵袭转移的影响。结果发现:应用免疫细胞荧光、real-time PCR和Western blot检测Capn4在4种侵袭转移潜能不同人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6中存在表达差异,其mRNA及蛋白表达水平随细胞侵袭转移潜能增强而升高。在化学合成的三对siRNA中,在细胞融合度为40～50%、siRNA浓度为150nM时,应用real-time PCR检测Capn4表达的抑制率分别为63.1%,66.6%和81.6%,与阴性对照siRNA相比,差异具有统计学意义（P＜0.01）,我们选择干扰效果最好的第三对siRNA进行下面的体外干扰实验。结果发现,Capn4-s3siRNA转染48h时,Capn4表达的mRNA抑制效果最佳,转染72h时,Capn4表达的蛋白水平抑制70%以上,该实验结果提示,干扰48小时后进行功能验证实验较好。细胞侵袭、运动实验发现,相比于阴性对照组（25.3±4.34和33.3±4.65）和空白组（28.3±5.56和34.8±5.91）,Capn4干扰组（10.8±2.75和16.3±3.4）穿越的细胞显著减少（P＜0.05）。细胞划痕实验发现抑制细胞分裂48h后,相比于阴性对照组和空白组,在Capn4干扰组中细胞迁移速度显著降低。应用MTT实验检测Capn4干扰后对HCCLM6细胞增殖力的影响,与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组细胞生长明显受抑（P＜0.05）。细胞克隆形成实验发现,与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组细胞克隆明显减少（P＜0.05）。但是,流式细胞仪检测细胞生长周期和凋亡的影响,发现与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组虽有差异,但无统计学意义（P＞0.05）。另外,我们构建慢病毒载体,分别将转染后空白组、阴性对照组（Lenti.Capn4-neg）、Capn4干扰组（Lenti.Capn4-s3）的三组HCCLM6细胞（5×106/只）裸鼠皮下接种,6周后观察裸鼠的成瘤和肺转移。结果显示Capn4干扰组组裸鼠成瘤率（33.3%）明显低于空白组（100%）和阴性对照组（100%）,且肿瘤体积较小,其中,Capn4干扰组为381±202.6mm3,而阴性对照组为3889.6±2407.6 mm3,空白组为4543.8±1351.8 mm3（P＜0.001）。肺组织切片检测发现空白组、阴性对照组、Capn4干扰组三组肺转移率分别为100%、83.3%和16.7%,单个肺转移灶的数目分别为13±1.4个、11.5±3.4个和1.3±1.6个,差异有显著性（P＜0.01）;此外,Capn4干扰组肺转移灶都以Ⅰ期为主,空白组和阴性对照组还可见到第Ⅳ期转移灶。结果表明:Capn4的表达随肝癌细胞侵袭转移潜能增强而增高;在体外,抑制Capn4的表达可降低HCCLM6细胞的侵袭、运动、迁移能力和增殖能力,而对HCCLM6细胞周期和凋亡没有显著性影响。在体内实验中,Capn4表达下调后,抑制裸鼠皮下成瘤和肺转移。第三部分下调Capn4抑制肝癌侵袭运动能力机制的初步研究为阐明下调Capn4的表达能明显抑制肝癌细胞的体内外侵袭运动能力的可能机制。我们应用明胶酶谱实验检测空白组,阴性对照组、Capn4干扰组中HCCLM6细胞MMP分泌的情况,结果发现与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组HCCLM6细胞MMP-2的分泌明显受抑（P＜0.001）;扫描电镜检测细胞伪足的形成,发现干扰组细胞的伪足形成明显受到抑制,而且数量明显减少;应用免疫共沉淀技术发现,Capn4可能与黏着斑中的FAK和Talin相互作用,Capn4干扰后,与空白和阴性对照组相比,细胞内活化的p-FAK降低,而Talin的表达增加,说明Capn4可能介导了FAK的磷酸化和Talin的降解,从而影响黏着斑的分解和细胞迁移运动,提示黏着斑在Capn4影响肝癌细胞的迁移过程中具有重要的作用。结果表明:Capn4的下调,一方面减少细胞分泌MMP-2;另一方面影响细胞伪足的形成,减少Talin的降解,抑制FAK的磷酸化,影响黏着斑的分解和细胞迁移运动,从而抑制了肝癌细胞的体内外的侵袭和转移能力。第四部分Capn4在肝癌肝移植患者原发瘤组织中的表达及临床意义的研究本部分利用组织芯片和免疫组化技术检测192例肝癌原发瘤组织中Capn4的表达情况,比较分析Capn4的表达与临床病理特征以及生存率的关系,以受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC curve）比较肝癌原发瘤组织Capn4表达与术后肿瘤转移复发的相关性,评价Capn4作为肝癌肝移植术后预后判断指标的意义。结果发现:Capn4在原发瘤与癌旁组织之间存在差异表达（P＜0.05）,Capn4表达升高与肿瘤多发、单个肿瘤最大直径＞5cm、肿瘤无完整包膜、肿瘤侵犯血管、以及肿瘤了NM分期晚等临床病理因素相关（P＜0.05）,Capn4阴性组和阳性组间无瘤生存率之间存在显著性差异,而两者总体生存率之间无显著性差异;ROC曲线提示肿瘤组织中Capn4的表达越高,肝癌的转移复发可能性越高。结果表明:Capn4蛋白表达水平与肝癌肝移植的转移复发相关,可能成为预测肝癌肝移植术后转移复发的新指标。结论1.LCM结合定量蛋白质组学,是可行的较新的蛋白质组学研究策略之一,本研究筛查出一系列肝癌肝移植术后转移复发相关差异蛋白,可能作为潜在的移植术后肿瘤转移复发预测新指标和治疗新靶点。2.人肝癌细胞系中Capn4表达量的高低与细胞侵袭转移潜能强弱相关。抑制高侵袭转移潜能细胞中Capn4的表达可以降低其运动侵袭能力,提示差异蛋白Capn4通过增强肝癌细胞的运动侵袭能力来参与肝癌细胞的侵袭转移过程。3.Capn4的下调,减少了细胞分泌MMP-2;并且减少了Talin的降解,抑制FAK的磷酸化,从而抑制了肝癌细胞的体内外的侵袭和运动能力。4.Capn4在预测肝癌的侵袭力中具有一定的临床意义,Capn4阳性表达是肝癌预后不佳的信号。联合分析Capn4与其他临床病理指标,对于判断肝癌肝移植患者术后肿瘤是否有转移复发的可能,有一定的参考价值。潜在应用价值1.Capn4可作为肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的预测指标和潜在治疗靶点。2.Capn4的上游和下游调控的进一步研究,有助于揭示肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的分子机制。创新点1.利用LCM和最新蛋白质组学技术,克服了以往传统技术上的一些弱点,并且首次采用肝癌肝移植标本研究肝癌转移复发,排除了多中心发生对预后资料的影响,筛查出一系列关键差异蛋白分子。2.首次证实差异蛋白Capn4在肝癌肝移植术后肿瘤转移复发中发挥关键作用,有助于对肝癌肝移植术后肿瘤转移复发机制的理解,有助于寻找新的治疗靶点。3.Capn4可能成为预测肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的新指标。