论文摘要
肝纤维化（Hepatic fibrosis）是由多种病因导致的慢性肝病的共同病理学改变,是各种慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展的主要病理基础,其致病因素以乙型肝炎病毒和酒精为主,但在不同地区有一定差异。我国是慢性肝病的高发区域,其发病以慢性乙型肝炎所致排在首位。据世界卫生组织统计,全球目前有3.5亿慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染者,其中约75%分布在亚太地区,我国是HBV感染率较高的地区之一据不完全统计,HBV感染者已达1.2亿人左右,人群乙型肝炎表面抗原（HBsAg）检出率高达9.75%,而西欧各国以酒精为肝纤维化的主要原因,在我国随着人民生活水平的提高,酒精性肝纤维化也呈上升的趋势。据最近统计资料显示,我国目前有肝病患2000多万,肝纤维化在我国的发病率较高,是我国人民必须严肃对待的一个健康问题。因此,寻找防治肝纤维化的有效方法和有效药物,是我国人民的迫切要求,具有深远的意义和重大的社会价值。肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时的一个愈合修复过程,又是所有慢性肝病进展成肝硬化的共同病理基础。有效的治疗肝纤维化可以防止各种慢性肝病向肝硬化发展。近年来,国内外在对肝纤维化启动和进展机制的研究方面取得了一定进展。但是在肝纤维化临床治疗领域,并没有取得明显的进步。当前,临床虽然已有一些治疗肝纤维化的中西药物,但疗效还不够理想,而且有些药物副作用较大,费用较高。所以国内外的研究者都在努力寻找疗效确切、价格低廉、毒副作用小的防治肝纤维化药物,以便能阻止和逆转肝纤维化的进程,最终治愈大多数慢性肝病。在我国,肝纤维化、肝硬化大多数与病毒性肝炎有关,往往是由于慢性病毒性肝炎迁延变化而成的,针对慢性肝炎肝纤维化的病理特征,本文拟在以前工作的基础上,采用DMN诱导的肝纤维化模型,从病理观察、血清生化指标等进一步阐明自拟加味大黄蜇虫丸抗肝纤维化的有效性:并拟采用免疫组化、细胞培养技术、流式细胞术、分子生物学方法（RealTime-PCR技术）从细胞凋亡、纤溶系统两方面对该方抗肝纤维化的作用机理进行研究,为该方的进一步推广与开发应用提供实验依据。1.通过对DMN肝纤维化大鼠模型,观察加味大黄蜇虫丸肝组织肝HA、LN、IVC、PCIINP及HyP的影响。结果显示:模型组及各给药组血清HA、LN、IVC、PCIII及HyP的水平均升高,与正常组比较,有显著性差异（P＜0.01）。复方水提大、小剂量组与模型组比较,血清HA、PCIII、LN、CIV及HyP水平均明显下降（P＜0.05或0.01）,且大剂量组优于小剂量组;醇提大剂量组与模型组比较,血清LN、IVC、PCIII及HyP的水平有一定程度下降,但无显著意义（P＞0.05）。醇提小剂量组与模型组比较,血清PCIII、CIV、HyP水平有下降,但无显著意义（P＞0.05）。鳖甲软肝片组血清HA、PCIII、LN、CIV水平较模型组无显著差异（P＞0.05）。2.通过对DMN肝纤维化大鼠模型,观察加味大黄蜇虫丸对DMN肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响:（1）HE染色;（2）α-SMA免疫组化;（3）Ⅰ型胶原免疫组化。本实验表明,从肝小叶破坏、假小叶形成、胶原纤维增生等肝脏结构的客观改变出发,认为大黄蛰虫丸可减轻肝纤维化的程度,改善肝脏结构,促进ECM降解,从而治疗实验性肝纤维化。3.观察加味大黄蜇虫丸对HSC-T6体外生长的抑制作用,复方的TC50是42.15mg,丹参的TC50是1∶10的稀释浓度。（1）TIMP-1、MMP-2、MMP-13mRNA表达（2）提取细胞RNA。培养细胞经药物作用24h后,按Trizol一步法提取细胞RNA,用荧光定量PCR检测HSC-T6细胞TIMP-1、MMP-2、MMP-13mRNA的表达情况本实验表明,加味大黄蛰虫丸可以有效减轻肝细胞炎症,改善并减轻肝纤维化程度,结合本实验数据证实,加味大黄蛰虫丸可通过调节uPA纤溶系统,间接调节ECM降解,促进ECM在肝内沉积,从而治疗肝纤维化。4.观察大鼠Fas/FasL、TNF-α凋亡基因mRNA的表达与加味大黄蜇虫丸的干预作用。结果显示:加味大黄蛰虫丸可明显上调大鼠肝组织及体外培养HSC Fas/FasL基因mRNA的表达,体内体外实验中其上调作用均优于阳性对照药。认为加味大黄蛰虫丸通过调节Fas/FasL系统诱导活化的HSC凋亡,从而逆转肝纤维化。5.观察体外培养的HSC Fas/FasL、TNF-α凋亡基因mRNA的表达与加味大黄蜇虫丸的干预作用。对HSC-T6细胞凋亡的影响。实验方法:Annexin V/PI双染结合流式细胞仪分析:实验结果:在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为（FITC-/PI-）,右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为（FITC+/PI+）;而右下象限为凋亡细胞,呈现（FITC+/PI-）。结果显示:加味大黄蛰虫丸和丹参注射液均可诱导HSC凋亡,其中加味大黄蛰虫丸30mg/ml剂量组较15mg/ml剂量组细胞凋亡明显;加味大黄蛰虫丸各剂量组诱导细胞凋亡的能力优于丹参注射液组。提示诱导HSC凋亡可能是加味大黄蛰虫丸发挥抗纤维化作用的机制之一。6.观察纤溶系统与加味大黄蜇虫丸抗肝纤维化的关系。结果:（1）各组大鼠肝组织uPA、PAI-1免疫组化图片:在正常对照组肝组织,uPA、PAI-1未见阳性表达。模型对照组肝组织,uPA主要分布于假小叶以及增生的纤维隔内,PAI-1在肝纤维化活跃的汇管区、肝细胞变性坏死处有明显阳性染色。加味大黄蛰虫丸可以有效减轻肝细胞炎症,改善并减轻肝纤维化程度,结合本实验数据证实,加味大黄蛰虫丸可通过调节uPA纤溶系统,间接调节ECM降解,促进ECM在肝内沉积,从而治疗肝纤维化。（2）HSC uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13 mRNA相对表达量:与细胞对照组比较,丹参注射液各浓度组及加味大黄蛰虫丸大、小剂量组均可调节uPA、PAI-1、TIMP-1及MMP-13mRNA的表达。加味大黄蛰虫丸30mg/ml剂量组对上述基因的表达调节优于其它各组。认为加味大黄蛰虫丸可通过调节uPA纤溶途径,间接调节MMPs的活性,促进ECM降解,逆转肝纤维化。本文利用DMN诱导的大鼠肝纤维化模型,从血清肝纤指标、肝脏HyP含量及肝脏组织形态改变3个层面对加味大黄蛰虫丸治疗实验性肝纤维化的作用进行了评价,证实该方可以逆转DMN所致的大鼠肝纤维化。体外实验以HSC-T6细胞作为模型,用MTT法检测了大黄蛰虫丸对HSC-T6增殖的影响,进一步证实加味大黄蛰虫丸具有抑制HSC增殖和活化的作用。从体内、体外探讨了加味大黄蛰虫丸对HSC凋亡的诱导作用及其凋亡的途径,表明加味大黄蛰虫丸可通过Fas/FasL系统介导的HSC凋亡发挥治疗肝纤维化的作用。体外实验以HSC-T6细胞作为研究平台,探讨加味大黄蛰虫丸对uPA纤溶途径的调节作用,证实加味大黄蛰虫丸可通过上调uPA和MMPs活性,促进ECM降解,逆转肝纤维化。
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