论文摘要
鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美属（Eimeria）的多种球虫寄生于鸡消化道引起的一种严重危害养鸡业发展的原虫病,全世界每年因鸡球虫病而造成的经济损失高达20亿美元以上。我国是养鸡大国,占世界总养鸡量的10 %,每年由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失难以估计。目前球虫病主要依靠药物防治,但由于球虫耐药性的不断增强以及药物残留肉蛋危害人体健康,使得药物防治鸡球虫病举步维艰,也迫使人们将目光转向免疫预防等替代控制方法。本研究对柔嫩艾美球虫扬州株（E.tenella,YZ株）子孢子表面抗原SO7基因进行了克隆、序列分析和原核表达,比较了常规佐剂、细胞因子和中药等3种不同类型佐剂对重组S07抗原免疫保护效果的影响,以及S07抗原对巨型艾美球虫（E.maxima）的交叉免疫保护作用,为在临床上利用亚单位疫苗控制鸡球虫病奠定基础。一、E. tenella YZ株SO7基因的克隆和序列分析以E.tenella YZ株卵囊孢子化培养7 h时提取的总RNA为模板,设计特异性引物,应用两步法RT-PCR技术扩增出SO7基因的特异性片段。将扩增片段插入pUCm-T载体,随机选择经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定为阳性的2个克隆分别进行测序分析,并对结果进行验证。结果显示,2个阳性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致,含一全长651个核苷酸的开放阅读框,富含AGC和CTG重复序列,编码区核苷酸与LS18株和BJ株的同源性均为99.5 %,与HB株同源性为99.4 %,与GD株同源性为99.7 %。推测其氨基酸序列与LS18株和GD株的同源性都为99.1 %,与BJ和HB株同源性为98.6 %。通过对其蛋白抗原性、表面可能性、亲水性、柔性区和二级结构等参数预测分析,发现YZ株核苷酸的变异未引起其蛋白主要特性和抗原表位的变化。二、SO7基因在大肠杆菌中的融合表达根据E.tenella YZ株SO7抗原基因的cDNA序列设计1对引物,经PCR从阳性质粒模板中扩增出SO7基因不含信号肽的编码区片段。将该基因片段酶切回收后按正确的阅读框架克隆入大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1谷光甘肽-S-转移酶基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-SO7,并经测序验证。重组菌经过IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot证实,SO7基因在大肠杆菌中得到了融合表达,融合蛋白分子量约为48 Ku。可溶性分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在。通过融合蛋白切胶免疫小鼠制备高免血清,经过间接ELISA检测其与E.tenella子孢子抗原反应的特异性,结果证实融合蛋白具有一定的免疫原性。三、重组大肠杆菌表达条件的优化对表达E.tenella SO7抗原重组基因工程大肠杆菌pGEX-6P-1- SO7/BL21的摇瓶表达条件如诱导时机、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度进行了优化研究。在所试条件中,诱导时机和诱导时间是影响表达的主要因素,诱导温度与IPTG浓度次之。诱导前培养时间以3 h为最佳,诱导时间以4.5 h为最佳。在34～40℃范围内,诱导温度对表达量的影响不大,以37℃最佳。IPTG浓度在0.008～1 mmol/L范围内,对表达量的影响不大。在优化的表达条件下,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量达到菌体总蛋白的37.5 %,为大量获得重组蛋白奠定了坚实的基础。四、重组SO7抗原对E.tenella的免疫保护效果对表达产物进行初步纯化和复性,制备免疫原。分别使用不同剂量的人参总皂甙和重组γ-干扰素以及弗氏完全佐剂作为免疫佐剂,于5日龄、12日龄和19日龄对雏鸡进行3次免疫,同时设立蛋白口服免疫组、蛋白皮下注射免疫组、卵囊口服免疫组、未免疫未攻毒组和未免疫攻毒组作对照,于26日龄用105个E.tenella孢子化卵囊进行攻毒,8 d后扑杀,对各组的存活率、相对增重率、病变减少率、相对卵囊产量和抗球虫指数（ACI）等指标进行统计分析,比较免疫保护效果。结果表明,与非免疫攻毒组及不加佐剂的免疫攻毒组相比,佐剂使用后各组的增重、病变记分、相对卵囊产量、ACI等指标均有一定的改善,对E.tenella的攻击可以提供部分保护。3种佐剂中,γ-干扰素和人参总皂甙能增强重组抗原的免疫保护效果,且佐剂的剂量对免疫保护的效果有一定的影响,以5 000 Uγ-干扰素效果最佳,效果与E.tenella活卵囊免疫相当,弗氏完全佐剂的免疫增强效果不明显。单独使用重组蛋白皮下注射或口服免疫,虽有一定的保护作用,但不明显。一定剂量的γ-干扰素对重组抗原的免疫保护效果起明显的增强作用,是一个具有很好的临床应用前景的新型佐剂。五、重组SO7抗原对E.maxima的交叉免疫保护效果采用5 000 U重组γ-干扰素作为重组蛋白的免疫佐剂,于5日龄、12日龄和19日龄对雏鸡进行3次免疫,同时设立蛋白皮下注射免疫组、E.tenella卵囊口服免疫组和E.maxima卵囊口服免疫组、未免疫未攻毒组和未免疫攻毒组作对照,于26日龄用5×104个E.maxima卵囊进行攻毒,8 d后扑杀,以平均增重、相对增重率、卵囊产量、相对卵囊产量等指标评价其交叉免疫保护效果。结果显示,E.maxima卵囊口服免疫对E.maxima保护效果最佳,单独使用重组蛋白皮下注射对增重的改善和卵囊产生的抑制作用不明显,而E.tenella口服免疫对E.maxima的感染没有交叉保护作用。以5 000 Uγ-干扰素作为佐剂,重组蛋白对E.maxima的感染具有部分交叉保护作用,对增重有一定的改善,效果与E.maxima卵囊口服免疫相当,但对卵囊产生的抑制作用不明显。