人参皂苷Rg1的生物转化与关键酶的研究

论文摘要

药理研究表明，人参皂苷F1（ginsenoside F1，GF1）能够诱导调节缝隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）减弱、抑制人体骨肉瘤细胞U2OS的增殖、减少UV-B导致的细胞死亡并防止UV-B诱发的人类HaCaT角化细胞凋亡、拮抗人的血小板凝集。但令人遗憾的是GF1在自然界中含量甚微所以从天然人参中提取十分困难，而GRg1的获得相对容易，而且它的结构与GF1十分相似，仅多一个糖基，去掉GRg1分子C6侧链的O-Glc中的β-葡萄糖基，即可得到GF1。因此，如何能高效地获得更多更纯的GF1，具有极其重要的经济意义和药用价值。本文研究人参皂苷Rg1的生物转化，并分离得到生物转化的关键酶。经MS，13C NMR和HPLC鉴定转化产物为GF1。实验菌株经传统形态学和ITS-5．8S序列分析鉴定为菌核青霉（Penicillium sclerotiorum），所产β-D-葡萄糖苷酶为胞外组成酶，该酶被纯化了94．65倍后达电泳纯。实验证明所得β-D-葡萄糖苷酶为分子量200kDa的糖蛋白，是含有多个40kDa亚基的寡聚酶，最适pH4．5，最适温度65℃，pI6．5。在金属离子终浓度为1mmol／L时，Ba2+、Fe3+、Co2+和K+对酶有激活作用，而Mg2+和Ag+能抑制该酶活性。经过底物特异性实验，证实所得β-D-葡萄糖苷酶对GRg1C6位葡萄糖苷键有较强的立体结构专一性。初步转化工艺研究结果确定了生物转化的培养基，并确定了较优的转化条件。经过优化实验，人参皂苷Rg1定向转化至人参皂苷F1的最高生物转化率可达72％，较原始培养基提高了30％，生产成本亦得到大幅度降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 人参皂苷的生物转化研究
• 1.1.1 酶解法
• 1.1.2 微生物转化法
• 1.2 β-葡萄糖苷酶的研究概况
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的分类
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法
• 1.2.3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质
• 1的主要药理作用'>1.3 人参皂苷Rg₁的主要药理作用
• 1对中枢神经系统的作用'>1.3.1 GRg₁对中枢神经系统的作用
• 1对心血管系统的作用'>1.3.2 GRg₁对心血管系统的作用
• 1对内分泌系统的作用'>1.3.3 GRg₁对内分泌系统的作用
• 1对免疫系统的作用'>1.3.4 GRg₁对免疫系统的作用
• 1的研究进展'>1.4 人参皂苷F₁的研究进展
• 第二章 生物转化底物与产物分离分析方法的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 底物与产物HPLC检测方法的建立
• 1的分离纯化'>2.2.2 GRg₁的分离纯化
• 2.2.3 转化产物的分离纯化
• 2.2.4 底物与产物的结构鉴定方法
• 2.2.5 底物与产物的含量标准曲线的绘制
• 2.3 实验结果
• 1的鉴定'>2.3.1 GRg₁的鉴定
• 2.3.2 转化产物的鉴定
• 2.3.3 底物与产物HPLC检测方法的建立
• 2.4 小结
• 2.5 讨论
• 第三章 菌株2246的鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 引物
• 3.1.3 酶与试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 点种培养法
• 3.2.2 插片培养法
• 3.2.3 琼脂槽法
• 3.2.4 制备霉菌浸片
• 3.2.5 菌株2246基因组DNA的提取
• 3.2.6 ITS-5.8S片段的PCR扩增
• 3.2.7 PCR产物的纯化
• 3.2.8 ITS-5.8S片段的测序
• 3.2.9 菌株2246的系统进化树分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 菌落形态
• 3.3.2 产孢结构形态
• 3.3.3 PCR扩增产物
• 3.3.4 ITS-5.8S序列的进化分析
• 3.4 小结
• 3.5 讨论
• 第四章 β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化及性质研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 填料
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌体产酶方式的初步考察
• 4.2.2 粗酶的制备
• 4.2.3 β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 4.2.4 β-D-葡萄糖苷酶分子量的测定
• 4.2.5 β-D-葡萄糖苷酶的电泳
• 4.2.6 β-D-葡萄糖苷酶活性检测
• 4.2.7 β-D-葡萄糖苷酶蛋白含量的测定
• 4.2.8 β-D-葡萄糖苷酶等电点的测定
• 4.2.9 pH及温度对β-D-葡萄糖苷酶活性的影响
• 4.2.10 糖蛋白染色
• 4.2.11 金属离子对β-D-葡萄糖苷酶活性的影响
• 4.2.12 β-D-葡萄糖苷酶动力学参数的测定
• 4.2.13 β-D-葡萄糖苷酶底物水解特异性
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 菌体产酶方式的研究
• 4.3.2 β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 4.3.3 β-D-葡萄糖苷酶分子量的测定
• 4.3.4 β-D-葡萄糖苷酶的纯度测定
• 4.3.5 β-D-葡萄糖苷酶活性检测
• 4.3.6 β-D-葡萄糖苷酶蛋白含量的测定
• 4.3.7 β-D-葡萄糖苷酶等电点的测定
• 4.3.8 β-D-葡萄糖苷酶的最适温度及pH
• 4.3.9 糖蛋白染色
• 4.3.10 金属离子对β-D-葡萄糖苷酶活性的影响
• 4.3.11 β-D-葡萄糖苷酶动力学参数的测定
• 4.3.12 β-D-葡萄糖苷酶的底物特异性研究
• 4. 小结
• 5. 讨论
• 第五章 菌种的初步转化工艺研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 单因子实验考察培养基组成
• 5.2.2 培养基碳源/氮源（C/N）组成及配比的选择
• 5.2.3 种子/转化培养基优化组合
• 5.2.4 种子培养基初始pH对生物转化的影响
• 5.2.5 种龄对生物转化的影响
• 5.2.6 转种量对生物转化的影响
• 5.2.7 转化培养基初始pH对生物转化的影响
• 5.2.8 替代实验
• 5.2.9 溶氧量对生物转化的影响
• 5.2.10 投料时间对生物转化的影响
• 5.2.11 投料量对生物转化的影响
• 5.2.12 转化终点的测定
• 5.2.13 金属离子对生物转化的影响
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 单因子实验考察培养基组成
• 5.3.2 培养基碳源/氮源（C/N）组成及配比的选择
• 5.3.3 种子培养基与转化培养基初步筛选
• 5.3.4 种子培养基初始pH对生物转化的影响
• 5.3.5 转种量对生物转化的影响
• 5.3.6 种龄对生物转化的影响
• 5.3.7 转化培养基初始pH对生物转化的影响
• 5.3.8 替代实验
• 5.3.9 溶氧量对生物转化的影响
• 5.3.10 投料时间对生物转化的影响
• 5.3.11 投料量对生物化的影响
• 5.3.12 转化终点的测定
• 5.3.13 金属离子对生物转化的影响
• 5.4 小结
• 5.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢