降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究及其基因组Fosmid文库构建

论文摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）,又名呕吐毒素（vomitoxin）,主要是由镰刀菌产生的真菌毒素,该毒素广泛存在于大麦、小麦、玉米、高粱、燕麦等谷类作物中。不仅影响粮食的产量和品质,而且可以通过食物链在人畜体内积累,进而危害人畜的健康。目前主要利用一些物理、化学和生物学手段等去毒技术来处理DON的毒害。与传统的物理和化学方法相比,只有生物学方法才可以解决存在的问题,因而关于消除真菌毒素的污染,采用生物学方法成为目前研究的热点和焦点。采用生物学手段筛选降解真菌毒素的高效降解菌,并使该降解菌在实践中发挥应有的作用,对保证食品安全,减少粮食、畜牧业的经济损失有积极意义。本课题组在之前的研究中已经分离到一株高效降解DON的菌株,即Devosia sp.DDS-1。以往的研究表明,DDS-1首先把DON乙酰化为3-AC-DON,然后3-AC-DON往下氧化为3-酮基-DON,接下来再进一步降解。本论文主要通过研究DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性,以期掌握DDS-1降解3-AC-DON（?）3-酮基-DON特性,为该酶的开发利用奠定理论基础；还构建了该菌的Fosmid文库,为克隆其降解功能基因提供技术平台。本论文酶学实验结果显示,Devosia sp. DDS-1产生3-AC-DON氧化酶的最适条件为：pH值-7.0、25℃、培养36小时。3-AC-DON氧化酶的最适反应条件是：温度35℃,pH值-7.0；该酶在20～40℃,pH 5.0～9.0的范围内能保持80%以上的酶活；大多数金属离子在浓度为0.2 mmol·L-1和2 mmol·L-1之间对3-AC-DON氧化酶有促进作用；EDTA对该酶活有抑制作用,结果表明该氧化酶需要金属离子作为酶反应的辅因子；酶的定域实验表明,DDS-1中的3-AC-DON氧化酶属于胞内酶；DDS-1产生的粗酶液能很好地降解小麦中的DON,3-AC-DON,15-AC-DON毒素。本论文构建了Devosia sp. DDS-1的基因组Fosmid文库。为了获得高质量的DDS-1基因组DNA,本论文采用三种方法提取基因组DNA,分别是CTAB/NaCl法,试剂盒法和改进的试剂盒法,结果表明,相较于传统的CTAB/NaCl法,采用改进的试剂盒提取法,即在普通试剂盒提取的基础上,加上酚/氯仿/异戊醇,氯仿/异戊醇等流程,大大提高了基因组DNA的质量。该文库共包含2000个克隆,平均插入片段大小为35 kb,初步估计总容量为70 Mb,覆盖Devosia sp. DDS-1基因组（按5M计算）14倍,克隆产物在继代培养中没有发生明显变化,该文库可以满足基因组测序、基因克隆的要求。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素污染
• 1.1 毒素危害的概述
• 1.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染
• 1.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生影响因素
• 1.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的结构与理化性质
• 1.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性机理
• 1.5.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇急性毒性作用
• 1.5.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇慢性毒性作用
• 1.5.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的致畸、致突变、致癌作用
• 1.5.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的细胞毒性作用
• 1.5.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的免疫毒性与联合毒性作用
• 1.6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇与人类疾病的关系
• 1.7 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准
• 2. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分离与检测技术
• 2.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的提取
• 2.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的净化
• 2.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法
• 2.3.1 生物学检测方法
• 2.3.2 物理化学检测法
• 2.3.2.1 薄层色谱法（thin-layer chomatography,TLC）
• 2.3.2.2 气相色谱法（gaschomatography,GC）
• 2.3.2.3 高效液相色谱法（high performance liquid chomatography,HPLC）
• 2.3.3 酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）
• 3. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱毒技术
• 3.1 物理方法
• 3.1.1 漂洗
• 3.1.2 热加工
• 3.1.3 离子辐照
• 3.1.4 无机吸附
• 3.2 化学方法
• 3.2.1 碱处理
• 3.2.2 氧化剂的氧化作用
• 3.2.3 还原剂作用
• 3.3 生物方法
• 3.3.1 微生物的菌体吸附作用
• 3.3.2 微生物降解
• 4. 国内外对微生物去除脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的研究进展
• 5. 基因组文库在微生物中的应用
• 5.1 基因组文库概述
• 5.2 大片段基因组文库
• 5.2.1 Cosmid文库
• 5.2.2 Fosmid文库
• 5.2.3 BAC文库
• 5.2.4 大片段基因组文库在微生物研究中的应用
• 6. 本研究的目的
• 6.1 目前存在的问题
• 6.2 本研究的目的意义
• 第二章 降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究
• 第一节 降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶酶液反应体系的建立
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种来源
• 1.1.2 培养基及试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 DDS-1种子液的制备
• 1.3.2 粗酶液的制备
• 1.3.3 粗酶液的纯化
• 1.3.4 酶活力测定方法
• 1.3.5 标准曲线
• 1.3.6 DON与3-AC-DON含量的计算方法
• 1.3.7 Devosia sp.DDS-1最适产酶条件
• 2. 结果与讨论
• 2.1 标准曲线的制作及线性关系
• 2.2 3-AC-DON降解酶的反应进程曲线与酶浓度曲线
• 2.3 硫酸铵饱和度的确定
• 2.4 菌株最适产酶条件
• 2.4.1 培养时间对DDS-1生长和产酶的影响
• 2.4.2 pH值对DDS-1生长和产酶的影响
• 2.4.3 培养温度对DDS-1生长和产酶的影响
• 2.4.4 最佳产酶条件的优化
• 3. 结论
• 第二节 降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的特性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株、培养基、试剂及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 DDS-1种子液的制备
• 1.2.2 粗酶液的制备
• 1.3 酶活力的测定
• 1.4 酶学性质的初步研究
• 1.4.1 温度对酶活的影响
• 1.4.2 pH对酶活的影响
• 1.4.3 酶的热稳定性
• 1.4.4 酶的酸碱稳定性
• 1.4.5 金属离子和EDTA对酶活的影响
• 1.5 3-AC-DON毒素氧化酶的定域试验
• 1.6 DDS-1粗酶液对小麦中DON,3-AC-DON,15-AC-DON的降解
• 2. 结果与分析
• 2.1 酶学性质
• 2.1.1 温度对酶活的影响
• 2.1.2 pH对酶活的影响
• 2.2 酶的定域试验
• 2.3 DDS-1粗酶液对小麦中DON,3-AC-DON,15-AC-DON的降解
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第三章 降解菌DDS-1基因组FOSMID文库构建
• 第一节 降解菌DDS-1基因组总DNA的提取
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种来源
• 1.1.2 培养基及试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因组DNA提取
• 1.2.2 电泳检测
• 2. 结果与分析
• 第二节 降解菌DDS-1基因组FOSMID文库构建
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种来源
• 1.1.2 培养基及试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 Fosmid文库构建流程
• 1.2.2 文库质量鉴定及评价
• 1.2.3 Fosmid克隆的PCR验证
• 2. 结果
• 2.1 合适片段DNA的制备
• 2.2 DNA片段回收
• 2.3 包装物滴度计算
• 2.4 文库质量鉴定
• 2.4.1 重组率、插入片段大小及文库覆盖度分析
• 2.4.2 Fosmid克隆稳定性鉴定
• 2.5 Fosmid克隆的PCR验证
• 3. 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢