TACI-Fc和BCMA-Fc融合蛋白的表达、纯化以及生物功能鉴定

论文摘要

B淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）,又称肿瘤坏死因子家族的B细胞活化分子（B cell-activating factor belonged to TNF family, BAFF）是一种重要的肿瘤坏死因子超家族成员。穿膜蛋白活化物（transmembrane activator and CAML interactor, TACI）和B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen, BCMA）与BAFF-R （BAFF Receptor）一起成为BLyS的三个受体。本文中我们进行了人TACI全长及胞外区基因的钓取,与人IgG1的Fc段的连接,构建其原核表达载体。并进行了TACI-Fc和BCMA-Fc重组蛋白的诱导表达、纯化及生物学活性的鉴定。旨在为进一步研究BLyS与其受体的相互作用模式和开发用于治疗自身免疫疾病的BLyS拮抗剂奠定基础。该项研究取得的主要结果如下:（1）经RT-PCR法成功克隆了编码人TACI的全长基因,大小约为900bp,测序结果与GenBank结果一致。（2）扩增的TACI胞外区与人IgG1的Fc段基因连接后插入原核表达质粒pET28a,成功地构建了重组原核表达质粒pET28a-TACI-Fc。（3）上述质粒和实验室已构建好的pET28a-BCMA-Fc重组质粒转化大肠杆菌BL21 （DE3）,经IPTG诱导,并优化诱导条件,获得了较高水平的表达。SDS-PAGE分析可见,分别在大约40kDa和35kDa处有目的条带。Western Blotting和ELISA实验也显阳性。Protein A亲和层析柱进行纯化,得到高纯度的融合蛋白TACI-Fc和BCMA-Fc。（4）已纯化的融合蛋白送北京进行MTT检测,结果表明TACI-Fc和BCMA-Fc融合蛋白可以阻断BLyS对Nalm-6细胞系的增殖作用,并且TACI-Fc较BCMA-Fc的阻断作用强。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 BLyS 的结构及组织分布
• 1.2 BLyS 的信号转导
• 1.3 BLyS 的受体
• 1.3.1 BAFF-R
• 1.3.2 BCMA
• 1.3.3 TACI
• 1.3.4 BLyS 受体与其他配体的相互作用
• 1.4 BLyS 的生物功能
• 1.4.1 BLyS 与B 细胞的关系
• 1.4.2 BLyS 与T 细胞的关系
• 1.4.3 BLyS 的细胞毒效应和caspase 激活
• 1.5 BLyS 相关的疾病
• 1.5.1 免疫缺陷病
• 1.5.2 自身免疫疾病
• 1.5.3 BLyS 与B 细胞恶性肿瘤
• 1.6 BLyS 作为靶点的应用前景
• 1.6.1 抗BLyS 单克隆抗体
• 1.6.2 BLyS 的可溶性受体
• 1.6.3 人可溶性BLyS 结合小肽
• 1.7 总结
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 细胞系
• 2.1.4 工具酶及试剂盒
• 2.1.5 常用试剂
• 2.1.6 主要实验仪器
• 2.1.7 溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 克隆TACI 全长基因
• 2.2.2 原核表达载体的构建
• 2.2.3 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.4 诱导表达蛋白的鉴定
• 2.2.5 目的蛋白的分离、纯化
• 2.2.6 TACI-Fc 和BCMA-Fc 的功能鉴定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 TACI 全长及胞外区的克隆
• 3.2 表达载体的构建
• 3.3 融合蛋白的诱导表达
• 3.3.1 TACI-Fc 融合蛋白的表达
• 3.3.2 BCMA-Fc 融合蛋白的诱导表达
• 3.4 Western Blotting 和ELISA 鉴定
• 3.5 融合蛋白的纯化
• 3.6 两种融合蛋白的生物功能鉴定
• 3.6.1 FACS 法检测Nalm-6 细胞系表面的BAFF-R 表达
• 3.6.2 MTT 测定细胞生长曲线，检测两种融合蛋白的生物活性
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢